李 華，馬明義，杜 亭，雷 娟，覃 維，張宇翔

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，四川瀘州 646000；3.瀘州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川瀘州 646000）

雄激素對(duì)男性個(gè)體發(fā)生、生長(zhǎng)發(fā)育和生殖功能等都起著十分重要的作用。雄激素必須通過靶器官上特異的雄激素受體（androgen receptor，AR）而起作用。雄激素不敏感綜合征（androgen insensitivity syndrome，AIS）是由于AR基因缺失、突變導(dǎo)致AR功能障礙或缺失引起雄激素的作用減弱或消失。遺傳方式為X-連鎖隱性遺傳，發(fā)病率為出生男嬰的1／64 000～1／20 000［1］。本研究通過對(duì)一AIS個(gè)體家系成員AR基因突變的檢測(cè)，探討AIS發(fā)病的分子病因。

1 資料與方法

1.1 病例 患者，28歲，因男性發(fā)育不足，無腋毛，陰莖短小、陰毛稀疏來瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科求診。性激素檢查：睪酮（T）升高41.32mmol／L，卵泡刺激素（FSH）87.45IU／L，雌二醇（E2）106.43pmol／L，促黃體素（LH）升高24.75IU／L；細(xì)胞遺傳學(xué)檢查核型為：46，XY，臨床診斷該患者為AIS。簽署知情同意書后，患者及其父母靜脈各抽血5mL供研究。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA的提取 患者及其家系成員、150名健康男性外周血基因組的DNA采用天根生化科技有限公司試劑盒提取，操作按說明書進(jìn)行。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增根據(jù)GenBank中AR基因序列（NM 000044.3），用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，對(duì)AR基因的全部8個(gè)外顯子及外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)分別進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序。引物合成和測(cè)序均由上海Invitrogen公司完成。外顯子1擴(kuò)增片段為2 100bp，除用正向和反向引物測(cè)序外，還設(shè)計(jì)了兩條測(cè)序引物，以期把該片段測(cè)通。引物序列、退火溫度、擴(kuò)增片段的大小及測(cè)序引物序列見表1。擴(kuò)增條件及參數(shù)：PCR反應(yīng)體系為50μL，其中dNTP 10pmol／L，MgCl21.5mmol／L，0.2μg基因組DNA，引物10pmol，TaKaRa Taq酶2U。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200型熱循環(huán)儀（MJ Research）上進(jìn)行，擴(kuò)增參數(shù)：冷啟動(dòng)，94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55～59℃復(fù)性30s，72℃延伸30s至2min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴乙啶染色，Gel Doc1000凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并保存電泳結(jié)果。

1.2.3 AR基因外顯子1c.528C＞A變異在健康男性中的檢測(cè) c.528C＞A變異導(dǎo)致了該處限制性核酸內(nèi)切酶AluI酶切位點(diǎn)的消失，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，F(xiàn)：5′-AGC TGC CCC ATC CAC GTT GTC C-3′；R：5′-GGA AGT GGG AGC CCC CGA GG-3′，擴(kuò)增片段為187bp，內(nèi)切酶AluI購置于NEB，酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴乙啶染色，Gel Doc1000凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并保存電泳結(jié)果。酶切后野生型片段為：133bp＋54bp；突變型為：187bp。

表1 雄激素受體基因各外顯子及c.528C＞A位點(diǎn)PCR擴(kuò)增條件和測(cè)序引物

續(xù)表1 雄激素受體基因各外顯子及c.528C＞A位點(diǎn)PCR擴(kuò)增條件和測(cè)序引物

2 結(jié) 果

AR基因8個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果，見圖1。c.528C＞A位點(diǎn)突變型和野生型男性AluI酶切后電泳結(jié)果，見圖2。c.528C＞A位點(diǎn)突變型和野生型男性測(cè)序結(jié)果，見圖3。

圖1 AR基因8個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果

圖2 c.528C＞A位點(diǎn)突變型和野生型男性AluI酶切后電泳結(jié)果

圖3 c.528C＞A位點(diǎn)突變型和野生型男性測(cè)序結(jié)果

3 討 論

AR基因是一單拷貝的X染色體基因。AIS可分為完全型雄激素不敏感綜合征（complete androgen insensitivity syndrome，CAIS）和部分型雄激素不敏感綜合征（partial androgen insensitivity syndrome，PAIS）。CAIS的臨床表現(xiàn)較為特異，診斷和鑒別較為容易。PAIS的臨床診斷和鑒別較為困難，容易與其他病因所致的男性性發(fā)育異?；煜?。在AR基因克隆之前，測(cè)定外陰皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)雄激素的結(jié)合力一直作為診斷AIS的金標(biāo)準(zhǔn)，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)了AR結(jié)合力正常的AIS［2-3］，因此AR基因的分子檢測(cè)是診斷PAIS患者較為準(zhǔn)確的方法。迄今，人類基因組突變數(shù)據(jù)庫收錄了AIS患者AR基因的343條突變。AR基因外顯子2～8是AIS的突變“熱區(qū)”［4］。目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)對(duì)AR基因突變的篩查僅篩查外顯子2～8［5-6］，雖外顯子1的突變較罕見，但也有外顯子1突變導(dǎo)致AIS的病例報(bào)道［7-9］。

本研究發(fā)現(xiàn)一PAIS患者外顯子1存在c.528C＞A變異，該變異由他母親傳遞而來，查閱相關(guān)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫證實(shí)該變異還未見報(bào)道。c.528C＞A變異雖未導(dǎo)致氨基酸的改變，但由于近年來的研究表明該類變異有可能影響mRNA的穩(wěn)定性和外顯子的剪接［10］，因患者拒絕提供外陰皮膚成纖維細(xì)胞，為評(píng)估該變異是否是AIS的致病病因，作者用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析法對(duì)150名健康男性AR基因c.528C＞A變異進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該變異在健康男性中也存在，頻率很低（3／150），所以該變異并不是該患者致病的病因，該患者致病位點(diǎn)的探尋還有待于進(jìn)一步研究。

目前報(bào)道的AIS患者的突變多位于外顯子上，但基因診斷中常發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)數(shù)量的PAIS患者全部外顯子檢測(cè)均未見異常，這些患者發(fā)病的病因很有可能是內(nèi)含子深處的變異導(dǎo)致AR基因mRNA的錯(cuò)誤剪接或剪接效率改變所致，但相關(guān)的研究獲得病人外陰皮膚成纖維細(xì)胞是關(guān)鍵。每一條新的AR基因功能性變異的發(fā)現(xiàn)都將豐富AR基因的突變譜，為診斷和預(yù)防AIS患者的出生提供理論依據(jù)和可能。

［1］Joshi RR，Rao S，Desai M.Etiology and clinical profile of ambiguous genitalia an overview of 10years experience［J］.Indian Pediatr，2006，43（11）：974-979.

［2］Amrhein JA，Meyer WJ 3rd，Jones HW Jr，et al.Androgen insensitivity in man：evidence for genetic heterogeneity［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1976，73（3）：891-894.

［3］Quigley CA，F(xiàn)riedman KJ，Johnson A，et al.Complete deletion of the androgen receptor gene：definition of the null phenotype of the androgen insensitivity syndrome and determination of carrier status［J］.J Clin Endocrinol Metab，1992，74（4）：927-933.

［4］Brown TR.Human androgen insensitivity syndrome［J］.J Androl，1995，16（4）：299-303.

［5］張蔚，李修琪.雄激素受體基因剪接受點(diǎn)突變G3346→T引起一例完全型雄激素不敏感綜合征［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2001，18（1）：14-16.

［6］田秦杰，黃尚志，郁琦，等.完全型雄激素不敏感綜合征中雄激素受體基因突變的檢測(cè)與分析［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，1995，4（4）：196-200.

［7］Lagarde WH，Blackwelder AJ，Minges JT，et al.Androgen receptor exon 1mutation causes androgen insensitivity by creating aphosphorylation site and inhibiting melanoma antigen-A11activation of N／C interaction-dependent transactivation［J］.J Biol Chem，2012，287（14）：10905-10915.

［8］Hannema SE，Scott IS，Hodapp J，et al.Residual activity of mutant androgen receptors explains wolffian duct development in the complete androgen insensitivity syndrome［J］.J Clin Endocrinol Metab，2004，89（11）：5815-5822.

［9］Choong CS，Quigley CA，F(xiàn)rench FS，et al.A novel missense mutation in the amino-terminal domain of the human androgen receptor gene in a family with partial androgen insensitivity syndrome causes reduced efficiency of protein translation［J］.J Clin Invest，1996，98（6）：1423-1431.

［10］Wang GS，Cooper TA.Splicing in disease：disruption of the splicing code and the decoding machinery［J］.Nat Rev Genet，2007，8（10）：749-761.