汪杰，曹騁

(1.海南省三亞市中醫(yī)院，海南 三亞 572000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006)

中藥工業(yè)

DM-130大孔吸附樹脂純化何首烏中二苯乙烯苷的工藝研究

汪杰1，曹騁2*

(1.海南省三亞市中醫(yī)院，海南 三亞 572000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006)

目的：研究DM-130型大孔樹脂對(duì)何首烏二苯乙烯苷的吸附性能及分離純化工藝參數(shù)。方法：采用HPLC測(cè)定二苯乙烯苷含量，計(jì)算DM-130大孔樹脂對(duì)二苯乙烯苷的吸附率和解吸率。結(jié)果：最佳工藝參數(shù)為上樣液濃度0.2 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥量)，上樣量為2.5 BV，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為3 BV。結(jié)論：DM-130大孔樹脂對(duì)何首烏二苯乙烯苷的純化效果較好，研究結(jié)果可為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

何首烏；二苯乙烯苷；DM-130大孔吸附樹脂

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonumMultiflorlumThunb.的干燥塊根，具有補(bǔ)肝、益腎、養(yǎng)血、祛風(fēng)之功效，能解毒，消癰，截虐，潤腸通便。用于瘡癰，瘰疬，風(fēng)疹瘙癢，久虐體虛，腸燥便秘[1]。何首烏主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類、糖類等成分。二苯乙烯苷具有抗衰老、降低膽固醇、提高免疫功能、防治動(dòng)脈硬化及保肝等作用[2]。大孔吸附樹脂吸附分離技術(shù)是一種純化新工藝，可以用于分離、富集中藥有效部位或有效成分[3-4]。DM-130大孔吸附樹脂是一種弱極性樹脂，適合分離弱極性及中等極性中藥成分[5]。為了更好地分離純化何首烏中二苯乙烯苷，發(fā)揮何首烏的藥效，作者主要研究考察DM-130樹脂對(duì)何首烏二苯乙烯苷的吸附性能及工藝參數(shù)，旨在尋找出最適宜的動(dòng)態(tài)吸附工藝，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT高效液相色譜儀；檢測(cè)器：SPD-10Av；色譜柱：Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；何首烏藥材(廣州致信中藥飲片有限公司)；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110844-200606)；DM-130型大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司)；乙腈為色譜純(科密歐)，水為蒸餾水，其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 何首烏上樣液的制備

稱取何首烏藥材粉末(過二號(hào)篩)適量，置圓底燒瓶中，加10倍體積50%乙醇，置恒溫水浴鍋中加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，高速離心(3 000 r·min-1)，取上清液，加50%乙醇調(diào)節(jié)溶液濃度至0.2 g·mL-1(相當(dāng)于生藥量)。

2.2 二苯乙烯苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈-水(25∶75)；檢測(cè)波長：320 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，加50%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取何首烏上樣液(或流出液)1 mL，置25 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，過微孔濾膜，濾過，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00 mL置5 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜。分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得線性方程Y=1 165 463 492X+607 235，r=0.999 6。結(jié)果表明2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)樣濃度在0. 2～1.6 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定二苯乙烯苷峰面積，結(jié)果峰面積的RSD=0.2%，表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 取同一已知準(zhǔn)確含量的供試品溶液6份，各精密加入二苯乙烯苷對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定二苯乙烯苷峰面積，計(jì)算二苯乙烯苷含量，計(jì)算回收率。測(cè)得平均加樣回收率為104.1%，RSD=2.6%。說明該測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.7 含量測(cè)定 按2.2.1及2.2.3項(xiàng)下方法，分別進(jìn)樣測(cè)定二苯乙烯苷峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

2.3 動(dòng)態(tài)吸附性能考察

2.3.1 大孔樹脂預(yù)處理[6]取DM-130大孔吸附樹脂適量，加乙醇浸泡3～5 d，待其充分溶脹后，用乙醇洗至流出液加適量水無白色渾濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗盡乙醇。

2.3.2上樣液濃度影響 稱取已經(jīng)預(yù)處理的DM-130大孔樹脂5 g，共5份，裝柱，另取濃度為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g·mL-1(相當(dāng)于生藥量)的上樣液10 mL，上樣，待吸附完全后，按2.2.6項(xiàng)下方法測(cè)定流出液中二苯乙烯苷含量，計(jì)算吸附率。結(jié)果見圖1。

圖1 上樣液濃度對(duì)DM-130型大孔樹脂吸附率的影響

由圖1可以看出，上樣液濃度為0.15 g·mL-1(相當(dāng)于生藥量)時(shí)，DM-130樹脂對(duì)二苯乙烯苷的吸附率達(dá)到最大，此后呈逐漸下降趨勢(shì)，但上樣液濃度為0.2 g·mL-1(相當(dāng)于生藥量)時(shí)的吸附率與0.15 g·mL-1(相當(dāng)于生藥量)時(shí)吸附率相比，兩者相差不大，從節(jié)省上樣時(shí)間角度考慮，故選擇上樣液濃度0.2 g·mL-1(相當(dāng)于生藥量)較為適宜。

2.3.3 最大上樣量的確定 稱取已經(jīng)預(yù)處理的DM-130樹脂10 g，裝柱，另取濃度為0.2 g·mL-1(相當(dāng)于生藥量)的上樣液，上樣，分段收集流出液，按2.2.6項(xiàng)下方法測(cè)定二苯乙烯苷含量，計(jì)算未吸附率。以藥液體積為橫坐標(biāo)，未吸附率為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線。結(jié)果見圖2。

圖2 最大上樣量考察

由圖2可知，開始時(shí)，隨著上樣液增加，未吸附率逐漸增加，2.5 BV后未吸附率顯著上升，此時(shí)二苯乙烯苷大量泄漏，樹脂對(duì)二苯乙烯苷的吸附能力顯著下降，故確定2.5 BV為最大上樣量，此時(shí)未吸附率未超過10%。

2.3.4 乙醇濃度考察 取DM-130樹脂10 g，裝柱，用上樣液吸附飽和，用水洗至流出液無色澄清后，依次以3倍柱體積30%，50%，70%，95%乙醇洗脫，按BV收集各段洗脫液。按2.2.6項(xiàng)下方法測(cè)定各段洗脫液中二苯乙烯苷含量，結(jié)果見圖3。

圖3 洗脫液濃度的影響

由圖3可得，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫液中二苯乙烯苷的含量逐漸增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%后，洗脫液中二苯乙烯苷含量增加不明顯，故確定洗脫液乙醇濃度為70%。

2.3.5 洗脫曲線 取已吸附飽和樹脂10 g，用蒸餾水洗脫除去水溶性雜質(zhì)，再以2 BV·h-1的流速和70%乙醇洗脫，按BV收集洗脫液。按2.2.6項(xiàng)下方法測(cè)定各段洗脫液中二苯乙烯苷含量，繪制動(dòng)態(tài)解吸曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 洗脫劑用量考察

由圖4可知，流脫液中二苯乙烯苷的量隨著洗脫劑體積的增大而逐漸減少，到第3BV時(shí)，二苯乙烯苷含量已經(jīng)很少，可認(rèn)為二苯乙烯苷已基本洗脫完全，故確定洗脫劑用量為3 BV。

2.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取DM-130樹脂10 g，上柱，按優(yōu)選出的最佳工藝參數(shù)上樣洗脫，即：上樣液濃度0.2 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥量)，上樣量為2.5 BV，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為3 BV。按2.2.6項(xiàng)下方法測(cè)定二苯乙烯苷含量，計(jì)算洗脫率。結(jié)果見表1。

表1 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，按選出的最優(yōu)工藝進(jìn)行吸附與洗脫效果較好，平均吸附率、洗脫率分別達(dá)到83.2%和84.6%。

3 結(jié)果與討論

DM-130大孔吸附樹脂是一種弱極性樹脂，適合分離純化弱極性和中等極性有機(jī)化合物。二苯乙烯苷類化合物多含有酚羥基,可作為良好的氫鍵供體,有利于被極性樹脂吸附。實(shí)驗(yàn)表明DM-130型樹脂對(duì)二苯乙烯苷類化合物具有較強(qiáng)的富集能力。實(shí)驗(yàn)研究初步確定DM-130大孔樹脂對(duì)何首烏二苯乙烯苷純化條件為：上樣液濃度0.2 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥量)，上樣量為2.5 BV，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為3 BV。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，DM-130樹脂對(duì)何首烏二苯乙烯苷的動(dòng)態(tài)吸附率、解吸率均在80%以上，純化效果良好。純化后二苯乙烯苷在干膏中的含量由6.9%提高至38.2%，表明DM-130樹脂純化何首烏二苯乙烯苷的工藝穩(wěn)定，方法可取,具有良好的應(yīng)用前景。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：164-165.

[2] 王文靜，薛詠梅，趙榮華，等. 何首烏的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,30(3)：60-64.

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[4] 何偉，李偉.大孔樹脂在中藥成分分離中的應(yīng)用[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2005,21(2)：134-136.

[5] 張旭，王錦玉，仝燕，等.大孔樹脂技術(shù)在中藥提取純化中的應(yīng)用及展望[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(6)：286-289.

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StudyonPurificationTechnologyofStilbeneGlycosideinPolygonummultiflorumThunb.withDM-130MarcoporousResin

WANG Jie1,CAO Cheng2*

(1.SanyaHospitalofTCM,Sanya572000,China； 2.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Objective： To study the conditions and parameters of purifying 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside inPolygonummultiflorumThunb..Methods： Use HPLC to determine the content of 2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside. Calculate the adsorption and Desorption rate.Results： The optimum process condition： solution concentration is 0.2 g·mL-1,the maximum sample volume is 2.5 BV,eluted by 70% 3BV ethanol.Conclusion： Adsorption purification effect of DM-130 marcoporous resin is good. The purification method is advisable,and can provide theoretical basis for practical production.

PolygonummultiflorumThunb.； Stilbene Glycoside； DM-130 marcoporous resin.

2012-12-27)

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曹騁，E-mail：caosir@126.com