金樹根 孫學(xué)華 雷 燕 李 曼 高月求，3△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)室 (上海，201203) 2.上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科

一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)在藥物體外抗病毒療效評(píng)價(jià)中，因價(jià)格相對(duì)便宜，病毒抗原蛋白含量檢測(cè)很多是采用ELISA檢測(cè)，雖不少研究采用人工合成的病毒抗原蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品做梯度稀釋并曲線擬合進(jìn)行病毒抗原蛋白定量［1，2］，更多實(shí)驗(yàn)中病毒抗原蛋白定量是簡(jiǎn)單直接采用OD值表示，認(rèn)為藥物對(duì)病毒抑制率 (%)=(空白對(duì)照組平均OD值－藥物干預(yù)組平均OD值)/空白對(duì)照組平均 OD值 ×100%，半數(shù)抑制濃度(50%concentration of inhibition，IC50，又稱半數(shù)有效濃度EC50)即為空白對(duì)照組平均OD值一半時(shí)的藥物濃度［3～5］。然而，在我們實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與基于CL、TRIF檢測(cè)技術(shù)可出陽(yáng)性結(jié)果并求出IC50不同，基于ELISA檢測(cè)技術(shù)的科華ELISA試劑檢測(cè)HBsAg和HBeAg時(shí)，同一藥物同一濃度采用目前計(jì)算方法卻沒有陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)法求出 IC50。鑒此，我們對(duì)基于ELISA檢測(cè)技術(shù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行IC50計(jì)算的方法學(xué)進(jìn)行研究，以便為病毒療效評(píng)價(jià)提供準(zhǔn)確信息。

1 材料與方法

1.1 一般材料 ①儀器:全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 (SpectraMax M5e，Molecular Devices;Powerwave XS Universal MQX200R，Biotek)，濾光片檢測(cè)技術(shù)的酶標(biāo)儀 (Multiskan Ex，F(xiàn)ortune-labsystems;KHB ST-360，上?？迫A公司，簡(jiǎn)稱科華)，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(I2000，美國(guó)ABBOTT公司，簡(jiǎn)稱ABBOTT)、時(shí)間分辨熒光分析儀 (Efficuta型，新波生物技術(shù)有限公司，簡(jiǎn)稱新波生物)。②試劑:HBsAg和HBeAg ELISA試劑盒 (科華)，HB-sAg和HBeAg CL診斷試劑盒 (ABBOTT)，HBsAg和HBeAg TRIF分析試劑盒 (新波生物)。③樣品:HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液 (本院細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 樣本預(yù)處理 將收集保存好的HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液解凍，用HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)上清液對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液進(jìn)行2、4、8、16、32、64、128倍稀釋，以備檢測(cè)用。

1.3 樣品檢測(cè) ①ELISA:將HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液原液和2、4、8、16、32、64、128倍稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)液，以HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)上清液為陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)照，按說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用450/630nm雙波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，OD=OD450－OD630。②CL分析:按說(shuō)明書，由曙光醫(yī)院檢測(cè)中心完成。③TRIF分析:按說(shuō)明書，由曙光醫(yī)院檢測(cè)中心完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用CurveExpert軟件分析對(duì)ELISA檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合并計(jì)算待測(cè)樣品的相對(duì)濃度。

2 結(jié)果

2.1 HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液不同稀釋倍數(shù)HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化 見表1。發(fā)現(xiàn)原倍對(duì)半稀釋 (真正IC50濃度)時(shí)OD值與原倍血清OD值不是對(duì)半的關(guān)系，有時(shí)相當(dāng)接近。

表1 HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液不同稀釋倍數(shù)HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化

2.2 HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液HBeAg ELISA檢測(cè)OD值與樣品濃度關(guān)系 見圖1。

圖1 HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液不同稀釋倍數(shù)HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化曲線

由圖1可見HBeAg濃度 (y軸)與OD值 (x軸)非直線相關(guān)，呈類似拋物線型曲線關(guān)系。采用相關(guān)系數(shù) (r)最接近1的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合進(jìn)行未知樣品檢測(cè)結(jié)果換算。

2.3 不同批次試劑、不同批次實(shí)驗(yàn)的HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化 結(jié)果見表2、圖2(A、B)以及表3、圖3(A、B)。其結(jié)果顯示，不同批次試劑、不同批次實(shí)驗(yàn)的HBeAg ELISA檢測(cè)OD值均各不相同，其OD值與樣品濃度關(guān)系呈類似拋物線型或S型等曲線關(guān)系。

表2 不同批次試劑HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化

圖2 不同批次試劑HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化曲線(其中A為2011年批次試劑，B為2008年批次試劑)

圖3 同批次試劑不同批次實(shí)驗(yàn)HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化曲線(其中A為20110325批次實(shí)驗(yàn)，B為20110331批次實(shí)驗(yàn))

表3 同批次試劑不同批次實(shí)驗(yàn)HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化

2.4 不同酶標(biāo)儀對(duì)HBsAg ELISA檢測(cè)OD值變化的影響 見表4、圖4(A～C)。因原實(shí)驗(yàn)室SpectraMax M5e酶標(biāo)儀儀器故障，我們改用另外一臺(tái)Fortune-labsystems酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)新鮮與冷藏樣品倍半稀釋，發(fā)現(xiàn)最高濃度樣品OD值偏低近1，而且樣品濃度與OD值呈S線型關(guān)系。我們進(jìn)而采用單位內(nèi)3臺(tái)不同酶標(biāo)儀進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)只有采用 Biotek酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果與SpectraMax M5e酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，而Fortune-labsystem酶標(biāo)儀與科華酶標(biāo)儀結(jié)果類似，高濃度樣品OD值偏低近1，而且樣品濃度與OD值呈S線型關(guān)系。

表4 不同酶標(biāo)儀對(duì)HBsAg ELISA檢測(cè)OD值變化的影響

圖4 不同酶標(biāo)儀對(duì)HBsAg ELISA檢測(cè)OD值變化曲線(其中A為Fortune-labsystems酶標(biāo)儀，B為Biotek酶標(biāo)儀，C為科華酶標(biāo)儀)

2.5 檢測(cè)樣品保存條件對(duì)HBeAg ELISA檢測(cè)的影響 見表5。

表5 檢測(cè)樣品不同保存條件對(duì)HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化的影響

與新鮮樣品相比較，檢測(cè)樣品冷藏對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果影響不大，樣品濃度與OD值仍呈類似拋物線型關(guān)系，但檢測(cè)樣品冰凍后復(fù)融對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果影響大，表現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中有時(shí)為1/2稀釋樣品的OD值反而比原倍樣品的OD值還高，樣品濃度與OD值仍呈類似S線型關(guān)系，特別是人的混合血清生理鹽水稀釋后檢測(cè)此現(xiàn)象多見 (數(shù)據(jù)從略)。

2.6 3種檢測(cè)方法檢測(cè)HBsAg和HBeAg含量的比較 見表6。CL、TRIF檢測(cè)結(jié)果有良好線性關(guān)系，但ELISA檢測(cè)進(jìn)行曲線擬合后，結(jié)果與CL、TRIF檢測(cè)結(jié)果相一致。

2.7 不同稀釋液對(duì)HBsAg和HBeAg ELISA檢測(cè)的影響 見表7。雖然不同稀釋液對(duì)HBsAg和HBeAg ELISA檢測(cè)OD值有影響，但進(jìn)行曲線擬合后，其結(jié)果是相一致的。

表6 HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液不同稀釋倍數(shù)HBsAg和HBeAg ELISA檢測(cè)與CL、TRIF檢測(cè)比較

表7 不同稀釋液對(duì)HBsAg和HBeAg ELISA檢測(cè)OD值變化的影響

3 討論

大量臨床報(bào)道，苦參素有良好的抗HBV作用，然而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們前期研究采用ELISA檢測(cè)HBsAg和HBeAg進(jìn)行苦參生物堿抗HBV作用研究發(fā)現(xiàn)，苦參素雖有一定的抗HBV作用，但因半數(shù)有效濃度 (IC50/EC50)高于或接近半數(shù)毒性濃度(TC50)，而無(wú)法求出SI(選擇指數(shù))/TI(治療指數(shù))，似與臨床結(jié)果不一致［5］。最近我們采用ELISA檢測(cè)HBsAg和HBeAg進(jìn)行白樺酯酸抗HBV作用研究，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與他人和我們以往研究結(jié)果相出入［6］，IC50和SI/TI均無(wú)法求出。同時(shí)，我們將樣品采用ABBOTT等試劑進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其結(jié)果表明白樺酯酸抑制HBeAg分泌的IC50與相關(guān)文獻(xiàn)相一致，SI/TI＞2。鑒此，為了對(duì)病毒療效評(píng)價(jià)提供準(zhǔn)確信息，我們對(duì)基于ELISA檢測(cè)技術(shù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方法學(xué)研究。

將HepG2.2.15細(xì)胞株培養(yǎng)上清液進(jìn)行梯度稀釋，采用ELISA進(jìn)行HBsAg和HBeAg檢測(cè)，我們驚異地發(fā)現(xiàn)，對(duì)半稀釋的樣品 (1/2稀釋液，相當(dāng)于50%病毒抑制率，即IC50)其OD值與沒有稀釋的樣品 (原液)OD值極為接近。而有時(shí)OD值是原液OD值一半時(shí)的稀釋倍數(shù)已達(dá)3倍以上 (即病毒抑制率75%以上)，有的竟高達(dá)50倍 (即病毒抑制率98%)，說(shuō)明以前采用病毒抑制率 (%)=(空白對(duì)照組平均OD值－藥物干預(yù)組平均OD值)/空白對(duì)照組平均OD值×100%這一作法完全低估了抗病毒藥物的作用。究其原因，可能是國(guó)內(nèi)研究人員誤將適用于線性相關(guān)的放免法檢測(cè)所得結(jié)果的此一計(jì)算方法移植于ELISA檢測(cè)所得結(jié)果的計(jì)算中［4，7］。

除樣品冰凍后復(fù)融實(shí)驗(yàn)結(jié)果病毒濃度與OD值擬合曲線均呈S型外，不同批次試劑、同批次試劑不同批次實(shí)驗(yàn)和其他不同樣品前處理的HBeAg ELISA檢測(cè)OD值均雖各不相同，病毒濃度與OD值擬合曲線雖均仍呈類似拋物線型，但ELISA檢測(cè)進(jìn)行曲線擬合后，結(jié)果與化學(xué)發(fā)光免疫、時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)結(jié)果相一致。不同稀釋液對(duì)HBsAg ELISA檢測(cè)具體OD數(shù)值有影響，但不影響曲線擬合類似拋物線型。因此，建議在今后采用ELISA檢測(cè)技術(shù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行IC50計(jì)算的抗病毒藥物作用的療效評(píng)價(jià)中，采用含病毒樣品梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行曲線擬合，以便能正確計(jì)算IC50和SI/TI，為抗病毒療效評(píng)價(jià)提供準(zhǔn)確信息。盡量不采用冰凍保存樣品的方法，或冰凍保存樣品采用合適稀釋，以便制作正確的標(biāo)準(zhǔn)曲線和正確檢測(cè)樣品中待檢物質(zhì)。

應(yīng)用不同的酶標(biāo)儀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)HBsAg ELISA檢測(cè)采用濾光片檢測(cè)技術(shù)的酶標(biāo)儀不僅OD值偏低，而且因最高濃度樣品OD值反低于其樣品倍半稀釋的OD值，致樣品濃度與OD值呈S線型關(guān)系，而全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀其OD值與病毒濃(滴)度呈拋物線關(guān)系。因此我們認(rèn)為如果采用濾光片檢測(cè)技術(shù)的酶標(biāo)儀，建議對(duì)所有樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以便制作正確的標(biāo)準(zhǔn)曲線和正確檢測(cè)樣品中待檢物質(zhì)。

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