宋紅麗 李瀚旻 林立生 高 翔 趙賓賓 張 軍 吳 雨 晏雪生 肖 玲

1.湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肝病研究所 (湖北武漢，430061) 2.湖北中醫(yī)藥大學2010級研究生班

肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠模型是病證結(jié)合的肝再生動物模型［1，2］前期研究結(jié)果表明，該模型能較好地揭示“腦髓生肝”、“骨髓生肝”和“精髓生肝”的科學內(nèi)涵，適用于研究高級神經(jīng)中樞、下丘腦-垂體-肝軸和神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡調(diào)控肝再生的作用及其機制［3，4］。本實驗研究通過動態(tài)對比觀察體現(xiàn)“補腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊對肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠肝再生的影響，探討“補腎生髓成肝”改善肝腎精虛證的生物學基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 SPF級wistar新生大鼠 (由湖北省疾病預防控制中心提供)，左旋谷氨酸單鈉 (Monosodium L-Glutamate，MSG)購自美國Sigma公司。體現(xiàn)“補腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊 (批號:鄂藥制藥字Z20113160)由湖北省中醫(yī)院肝病研究所提供。

1.2 分組與處理方法 新生大鼠112只于出生后第2、4、6、8、10時皮下注射MSG造模，每次4mg/g體重 (即MSG大鼠)。另取新生大鼠53只在相同時間點皮下注射等體積生理鹽水;48只新生大鼠不做任何特殊處理。28天后離乳，分籠飼養(yǎng)，光照時間12小時 (08∶00-20∶00)，溫度24℃左右，動物自由飲水、攝食。6周時從造模存活的MSG大鼠中取80只隨機分為兩組，每組40只:肝腎精虛/MSG-肝再生大鼠模型組 (簡稱模型組)和治療組。從皮下注射生理鹽水的53只大鼠中隨機取40只作為鹽水對照組 (簡稱對照組)。又從不做任何特殊處理的48只大鼠中隨機取40只作為正常大鼠肝大部分切除再生組 (簡稱PHx組)。治療組大鼠按3g/kg劑量給予地五養(yǎng)肝膠囊灌胃，其余兩組大鼠均以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃兩周后所有大鼠行肝大部分切除術(shù)。手術(shù)方法:無水乙醚吸入麻醉，腹部正中切口，暴露肝臟，按肝標準切除法［5］，在根部結(jié)扎并切除肝左葉和中葉 (約占全肝的68%)，分層縫合。MSG-大鼠按上述方法行肝大部切除后，即復制出肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠模型。PHx組和對照組大鼠按上述方法行肝大部切除后，即復制出經(jīng)典的肝再生大鼠模型。肝切除術(shù)均于上午08∶00～11∶00進行，以避免晝夜節(jié)律對肝再生的影響，術(shù)后實驗動物自由攝食、飲水，繼續(xù)給藥治療，方法同手術(shù)前。

1.3 標本處理 每組動物在術(shù)后1、3、7、10天時分別隨機取8只大鼠 (雌雄各半)，稱重后給予乙醚吸入麻醉。眼球取血后頸椎脫臼處死，快速取出肝臟并稱重，取出下丘腦和腦垂體。

1.4 計算肝再生度、肝再生指數(shù) 利用電子天平稱量肝臟濕重和動物體重，根據(jù)下列公式［6］計算肝再生度和肝再生指數(shù)。肝再生度=［B－(A/0.684－A)］/A;肝再生指數(shù) (%)=B/C×100%，其中，A為切除的左中兩葉之肝重，B為再生肝重，C為動物體重，0.684為切除的兩葉肝重與原肝重之比值。

1.5 計算再生肝肝細胞分裂指數(shù) 用手術(shù)刀切取小塊再生肝組織，10%甲醛溶液固定、石臘包埋，每只動物隨機選取5張切片，蘇木素-伊紅染色后于油鏡下 (×1000倍)觀察，計數(shù)肝細胞核總數(shù)和肝細胞核分裂數(shù)，共計數(shù)肝細胞核1萬個以上，根據(jù)公式計算肝細胞分裂指數(shù) (MI):MI(%)=肝細胞核有絲分裂象 (個)/肝細胞核總數(shù) (個)×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點肝再生度、肝再生指數(shù)和MI比較見表1。

表1 各組大鼠不同時間點肝再生度、肝再生指數(shù)和MI變化比較 (±s)

表1 各組大鼠不同時間點肝再生度、肝再生指數(shù)和MI變化比較 (±s)

與PHx組和對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 時段 肝再生度 肝再生指數(shù)(%)MI(%)0.22±0.08 1.46±0.13 0.86±0.16(n=32)術(shù)后3天 0.53±0.10 2.31±0.29 1.85±0.19術(shù)后7天 0.73±0.09 3.02±0.30 0.62±0.03術(shù)后10天 0.88±0.06 3.49±0.05 0.29±0.04對照組 術(shù)后1天 0.21±0.05 1.47±0.18 0.87±0.16(n=32)術(shù)后3天 0.54±0.09 2.33±0.42 1.81±0.04術(shù)后7天 0.71±0.11 3.07±0.13 0.67±0.18術(shù)后10天 0.90±0.10 3.46±0.05 0.28±0.05模型組 術(shù)后1天 0.34±0.10* 1.88±0.14* 1.05±0.12＊＊(n=32)術(shù)后3天 0.42±0.08* 2.07±0.04* 1.04±0.18*術(shù)后7天 0.57±0.12* 2.41±0.06* 0.41±0.16＊＊術(shù)后10天 0.70±0.08* 2.84±0.10* 0.15±0.03*治療組 術(shù)后1天 0.13±0.07 1.52±0.11# 0.77±0.14#(n=32)術(shù)后3天 0.50±0.05# 2.19±0.11# 1.89±0.13##術(shù)后7天 0.74±0.06# 2.84±0.12# 0.57±0.20##術(shù)后10天 0.86±0.03# 3.27±0.06# 0.28±0.04 PHx組 術(shù)后1天##

3 討論

中醫(yī)學有“肝腎同源于精血”的認識。我們前期研究結(jié)果表明，肝腎精血證是慢性肝病病程進展“髓失生肝”病因病機的基礎病證［7～13］。MSG-肝再生-大鼠模型是一種病 (肝臟病)-證 (肝腎精虛證)結(jié)合的動物模型。 “補腎生髓成肝”治療法則用于指導“髓失生肝”和“肝腎精虛證”的防治。肝腎精虛證的本質(zhì)是肝損傷與肝再生失衡，采用“補腎生髓成肝”減少肝損傷與調(diào)控肝再生是其根本大法［14，15］。地五養(yǎng)肝膠囊體現(xiàn)“補腎生髓成肝”治療法則。該方中熟地能甘溫補腎而養(yǎng)陰，五味子能增強補腎的功能，兩藥配合以補腎為主;茵陳清熱利濕退黃為主藥，姜黃辛溫通絡、活血化瘀為輔藥，生甘草清熱解毒，合為三瀉。五味子配甘草清熱養(yǎng)陰、酸甘化陰，合為佐使藥，全方共奏補腎而養(yǎng)肝、利濕而退黃、活血而通絡之功效。體現(xiàn)了“開源截流”、“補瀉兼施”的配伍規(guī)律，通過減少肝組織損傷和促進肝再生修復的雙重作用以治療慢性肝病肝腎精虛證，實現(xiàn)肝臟組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)和功能恢復。本實驗結(jié)果表明，肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠肝再生過程紊亂，表現(xiàn)為早期 (術(shù)后第1天)肝再生過亢，而中晚期肝再生抑制，經(jīng)地五養(yǎng)肝膠囊治療后，在肝腎精虛證改善的同時，其肝再生紊亂過程得到一定程度的糾正。提示地五養(yǎng)肝膠囊可能通過下丘腦-垂體-肝軸影響肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠肝臟再生修復，其作用機制尚有進一步研究的空間。

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