劉 欣，王炳勝，劉秀芳

數(shù)字化基因表達(dá)譜(digital gene expression profile)是利用新一代高通量測序和高性能的計算機(jī)分析技術(shù)，全面、經(jīng)濟(jì)、快速地檢測某一特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況，這一技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)制研究、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。放射性肺損傷是指胸部腫瘤患者在接受放射治療的過程中，正常肺組織因受到一定劑量放射線的照射而造成的不同程度的損傷，臨床表現(xiàn)為早期急性放射性肺炎和晚期肺纖維化，發(fā)生率為 16．3%～50．7%［1］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。放射性肺炎常發(fā)生在放療結(jié)束后1～3個月，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、少痰、胸悶、胸痛等。嚴(yán)重者表現(xiàn)為高熱、劇烈咳嗽、咯血痰、呼吸困難，不能平臥，甚至發(fā)生急性呼吸衰竭而導(dǎo)致病人死亡。放射性肺纖維化多發(fā)生于治療結(jié)束后3～6個月，表現(xiàn)為慢性呼吸衰竭等一系列相應(yīng)癥狀和體征。放射性肺損傷一旦發(fā)展到纖維化階段，幾乎不可逆轉(zhuǎn)，是限制放療療效的一個重要因素。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為放射性肺損傷的發(fā)生和腫瘤壞死因子、白介素等細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)有密切的關(guān)系［2］，但其分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過小劑量多次照射大鼠制造放射性肺損傷模型，用數(shù)字化基因表達(dá)譜分析放射性肺損傷發(fā)生時肺組織的差異表達(dá)基因，以尋找放射性肺損傷發(fā)生過程中的關(guān)鍵基因，為臨床靶向治療提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雌性成年Wistar大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g，合格證號:0172808。購自華阜康生物科技股份有限公司，分籠飼養(yǎng)。在SPF級實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)3 d，無異常者入組實(shí)驗(yàn)。將20只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為單純照射組(模型組)10只、空白對照組(對照組)10只。

1.2 主要試劑及儀器 Illumina Gene Expression Sample Prep Kit和Illumina測序芯片，Illumina Cluster Station和Illumina HiSeqTM2000系統(tǒng)均購于Illumina公司;6MV-X線直線加速器購于上海高科技放療設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物造模:模型組均采用6MV-X直線加速器照射右肺，照射前均使用0.4%戊巴比妥鈉10 ml/kg腹腔麻醉，俯臥于平臺，模擬機(jī)下定位，鉛塊遮擋左肺及縱隔，照射野面積3 cm×3 cm，每次5 Gy，每周1次，總劑量30 Gy。對照組只進(jìn)行麻醉，不予照射。

1.3.2 取材:于首次照射模型大鼠開始計時，兩組均于第6、12周末各隨機(jī)抽取5只大鼠，用0.4%戊巴比妥鈉10 ml/kg腹腔麻醉后立即開胸取右肺組織，保存于－80℃冰箱備用。

1.3.3 數(shù)字化基因表達(dá)譜信息分析流程

1.3.3.1 Tag的制備:提取 6 μl總 mRNA，利用Oligo(dT)磁珠吸附純化mRNA，并以O(shè)ligo(dT)引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。采用四堿基識別酶NlaⅢ，識別并切斷cDNA上的CATG位點(diǎn)，利用磁珠沉淀純化帶有cDNA 3＇端的片段，將其5＇末端連接Illumina接頭1。利用MmeI酶切CATG位點(diǎn)下游17 bp處，通過磁珠沉淀去除3＇片段后，在Tag 3＇末端連接Illumina接頭2，從而獲得兩端連有不同接頭序列的21 bp標(biāo)簽library。經(jīng)過15個循環(huán)的PCR線性擴(kuò)增后，通過6%TBE PAGE膠電泳純化95堿基條帶，解鏈后，單鏈分子被加到Illumina測序芯片上并固定，每條分子經(jīng)過原位擴(kuò)增成為一個單分子簇測序模板，加入4色熒光標(biāo)記的4種核苷酸，采用邊合成邊測序法測序。測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)通過熒光信號讀取堿基的方法轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，稱為原始Tag。

1.3.3.2 Tag的純化:原始序列帶有一段3＇adaptor序列，并且含有少量低質(zhì)量序列以及各種雜質(zhì)成分。經(jīng)過一系列數(shù)據(jù)處理，得到純化的Tag。

1.3.3.3 基因表達(dá)的注釋:經(jīng)過測序質(zhì)量評估、測序飽和度分析、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性分析、純化Tag拷貝數(shù)分布統(tǒng)計、純化Tag比對統(tǒng)計等一系列處理后對基因表達(dá)進(jìn)行注釋［3］。

1.3.3.4 差異基因的篩選:參照Audic等［4］的數(shù)字化基因表達(dá)譜差異基因檢測方法，開發(fā)了嚴(yán)格的算法篩選兩樣本間的差異表達(dá)基因。在本研究中，差異表達(dá)基因定義為假陽性率≤0．005且差異倍數(shù)在2倍以上(即Log2Ratio≥1)的基因。

1.3.3.5 確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能:通過基因本體(gene ontology，GO)功能顯著性富集分析、差異基因表達(dá)模式聚類分析等一系列后續(xù)處理后得出結(jié)果，確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。

2 結(jié)果

第6周末，模型組相比對照組的差異表達(dá)基因有1050個，其中上調(diào)基因?yàn)?69個，下調(diào)基因?yàn)?81個;根據(jù)特定規(guī)則找出顯著富集的GO條目，發(fā)現(xiàn)這些基因主要和細(xì)胞代謝過程相關(guān)。通過差異基因表達(dá)模式聚類分析顯示，上調(diào)基因主要與DNA鏈斷裂、細(xì)胞凋亡、特異性炎癥有關(guān)，下調(diào)基因主要與DNA/RNA合成代謝、細(xì)胞分裂有關(guān)，篩選出的差異表達(dá)基因見表1。

第12周末，模型組相比對照組的差異表達(dá)基因有2050個，其中上調(diào)基因?yàn)?33個，下調(diào)基因有1271個。找出顯著富集的GO條目，發(fā)現(xiàn)這些基因主要和應(yīng)激反應(yīng)、免疫過程有關(guān)。差異基因表達(dá)模式聚類分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要與炎癥因子、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、纖維化相關(guān)，下調(diào)基因主要與DNA/RNA合成代謝、細(xì)胞分裂有關(guān)。篩選出的差異表達(dá)基因見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠第6周末模型組對比對照組差異表達(dá)基因

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠第12周末模型組對比對照組差異表達(dá)基因

3 討論

放射性肺損傷主要分為早期放射性肺炎和晚期放射性肺纖維化，早期放射性肺炎主要發(fā)生于放療后的1～3個月，放射性肺纖維化主要發(fā)生于放療后的3～6個月［5-8］。本實(shí)驗(yàn)采用小劑量分次照射大鼠右肺，類似于臨床胸部腫瘤患者的放療方式，檢測時間定在照射開始后第6、12周末，可分別觀察早期放射性肺炎及晚期放射性肺纖維化發(fā)生初期時的差異表達(dá)基因。

DNA是電離輻射主要的靶分子之一，在細(xì)胞輻射損傷中發(fā)揮重要的作用。DNA鏈斷裂是細(xì)胞輻射損傷的重要形式，DNA雙鏈斷裂可造成細(xì)胞致死性損傷［3］。研究表明，即使是低劑量的X射線也能激發(fā)細(xì)胞的損傷修復(fù)機(jī)制［9］。本研究顯示，在照射后第6、12周末時均有DNA鏈斷裂、細(xì)胞凋亡等相關(guān)基因高表達(dá)，DNA/RNA合成代謝、細(xì)胞分裂等相關(guān)基因低表達(dá)，且在12周末時這些基因差異表達(dá)更明顯。表明放射性肺損傷造成細(xì)胞DNA鏈斷裂，并因此使細(xì)胞凋亡增多，DNA合成、細(xì)胞分裂等活動減少。因在第12周末時肺損傷較嚴(yán)重，故這些基因差異表達(dá)更明顯。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組金屬依賴性蛋白酶，能特異性的降解細(xì)胞外基質(zhì)，并可以被組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)特異性抑制。MMPs/TIMPs是影響細(xì)胞外基質(zhì)降解最主要的一組酶系，兩者的平衡在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中都起到重要作用［10］。生理狀態(tài)下細(xì)胞外基質(zhì)處于不斷產(chǎn)生和不斷降解的動態(tài)平衡中，細(xì)胞外基質(zhì)成分過度沉積是肺纖維化形成的關(guān)鍵，而膠原蛋白、纖維素連接蛋白及層粘連蛋白均是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分。因此，MMPs/TIMPs及膠原蛋白、纖維連接素、層黏連蛋白均與肺纖維化的形成有密切關(guān)系。本研究模型組對比對照組在第 6、12周末均有 MMP2、MMP9、MMP12、MMP14、TIMP1的高表達(dá)，且各基因在 12周末時差異表達(dá)更明顯，而12周末模型組膠原蛋白、層黏連蛋白及纖維素連接蛋白等纖維化相關(guān)基因明 顯 高 表 達(dá)，提 示 MMP2、MMP9、MMP12、MMP14、TIMP1參與了放射性肺損傷的形成，且在放射性肺損傷的不同時期差異基因表達(dá)不同。Araya等［11］通過體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞株，照射后發(fā)現(xiàn)MMP-2表達(dá)增高;Susskind等［12］報道了肺癌、乳腺癌患者放療后血漿中 MMP-9升高;Lee等［13］發(fā)現(xiàn)放射線可以導(dǎo)致MMP-2/TIMP-1平衡的改變，從而使Ⅳ型膠原蛋白降解減少，細(xì)胞外基質(zhì)沉積。MMP-12大多由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，主要作用于彈性蛋白，在肺纖維化形成過程中起重要作用［14］。Manetti等［15］證明MMP-12在系統(tǒng)性硬化病患者中血漿水平增高，并與其肺纖維化及血管損傷嚴(yán)重程度相關(guān)。李新春等［16］發(fā)現(xiàn)放射線照射后 MMP-12酶活性增高，并可能通過降解基底膜彈力纖維促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，啟動肺纖維化的發(fā)生。本研究亦發(fā)現(xiàn)在篩選出的差異表達(dá)基因中，MMP12差異表達(dá)更顯著，提示MMP12或可能是放射性肺損傷發(fā)生的關(guān)鍵基因。MMP-14是一個有效的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，它可以水解多種細(xì)胞外及細(xì)胞膜相關(guān)物質(zhì)蛋白，其表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［17］。但近年來并未有MMP-14與放射性肺損傷相關(guān)的報道。本研究中MMP14在放射性肺損傷早期及晚期均有明顯高表達(dá)，提示MMP14在放射性肺損傷發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，或可能是放射性肺損傷的又一敏感基因。

綜上所述，本研究用數(shù)字化基因表達(dá)譜分析了放射性肺損傷發(fā)生過程中的差異基因表達(dá)，了解到在放射性肺損傷形成的不同時期差異基因表達(dá)不同，MMP2、MMP9、MMP12、TIMP1 參與了放射性肺損傷的形成，并可能在激活炎癥因子方面起到重要作用。MMP2、MMP9、MMP12、MMP14、TIMP1 均為放射性肺損傷的敏感基因，但其與放射性肺損傷發(fā)生的具體關(guān)系不是十分清楚，有待進(jìn)一步研究;MMP12或可能是放射性肺損傷形成的關(guān)鍵基因，MMP14或可能是放射性肺損傷的又一敏感基因。

［1］ 張英杰，李建彬，田世禹，等．肺癌放療所致放射性肺損傷的相關(guān)因素分析［J］．中華腫瘤防治雜志，2008，15(16):1264-1267．

［2］ Arpin D，Perol D，Blay J Y，et al．Early variations of circulating interleukin-6 and interleukin-10 levels during thorscic radiotherray are predictive for radiation pneumonitis［J］．J Clin Oncol，2005，23(34):8748-8756．

［3］ Sutherland B M，Georgakilas A G，Bennett P V，et al．Quanitifying clustered DNA damage induction and repair by gel electrophoresis，electronic imaging and number average length analysis［J］．Mutat Res，2003，531(1-2):93-107．

［4］ Audic S，Claverie J M．The significance of digigal gene expression profiles［J］．Genome Res，1997，7(10):986-995．

［5］ 張曉敏，王炳勝，葛艷麗，等．益氣活血中藥治療放射性肺損傷臨床療效觀察［J］．中國綜合臨床，2011，27(9):908-910．

［6］ 接亞敏，韓北秋，喬文波，等．放射性肺損傷相關(guān)臨床因素的研究［J］．中華腫瘤防治雜志，2011，18(15):1201-1203．

［7］ 王曉萍，張道富，張新良，等．漢防己甲素防治放射性肺損傷的臨床觀察［J］．中華腫瘤防治雜志，2010，17(18):1457-1459．

［8］ 曹小飛，官健，陳龍華，等．放射性肺損傷大鼠肺組織Bcl-2和Bax表達(dá)變化及其意義的探討［J］．中華腫瘤防治雜志，2010，17(16):1249-1252．

［9］ Staaf E，Brehwens K，Haghdoost S，et al．Gamma-H2AX foci in cells exposed to a mixed beam of X-rays and alpha particles［J］．Genome Integr，2012，3(1):8．

［10］ Amalinei C，Caruntu I D，Giusca S E．Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions［J］．Rom J Morphol Embryol，2010，51(2):215-228．

［11］ Araya J，Maruyama M，Sassa K，et al．Ionizingradiationenhaneesmatrix metalloproteinase-2 produetion in human lung epithelial cells［J］．Am TPhysiol Lung Cell Mol-Physiol，2001，280(1):30-38．

［12］ Susskind H，Hymowitz M H，Lau Y H，et al．Inereased Plasma levels of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in lung and breast eaneerarealtered during chest radiotherapy［J］．Int J Radiation Oncology BiolPhy，2003，56(4):1161-1169．

［13］ Lee W H，Warrington J P，Sonntag W E，et al．Irradiation alters MMP-2/TIMP-2 system and collagen typeⅣdegradation in br［J］．Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，82(5):1559-1566．

［14］ Matute Bello G，Wurfel M M，Lee J S，et al．Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2007，37(2):210-221．

［15］ Manetti M，Guiducci S，Romano E，et al．Increased serumlevels and tissue expression of matrix metalloproteinase-12 in patients with systemic sclerosis:correlation with severity of skin and pulmonary fibrosis and vascular damage［J］．Ann Rheum Dis，2012，71(6):1064-1072．

［16］ 李新春，宋良文，楊蕾蕾，等．MMP-12異常表達(dá)對放射性肺損傷大鼠肺內(nèi)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響［J］．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，34(3):267-270．

［17］ Bodnar M，Szylberg L，Kazmierczak W，et al．Differentiated expression of membrane type metalloproteinases(MMP-14，MMP-15)and pro-MMP2 in laryngeal squamous cell carcinoma．A novel mechanism［J］．J Oral Pathol Med，2012，23(8):231-234．