完燕華，劉菊林，戰(zhàn)春燕，任芳媛

阿立哌唑(Aripiprazole，Ari)是日本大冢制藥公司(Otsuka公司)于1998年開發(fā)的第2代非典型性抗精神病藥，商品名為Abilify，是一種多巴胺自身受體激動(dòng)劑和5-羥色胺系統(tǒng)穩(wěn)定劑，用于精神分裂癥的治療［1］。2002年美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)該藥上市，2004年中國食品和藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準(zhǔn)該藥上市。阿立哌唑具有錐體外系反應(yīng)低、療效好、不良反應(yīng)輕、耐受性好的優(yōu)點(diǎn)［2］。國外多采用液相色譜－質(zhì)譜，質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定阿立哌唑在血漿中的濃度［3］，但其成本較高不便普及。為方便臨床對(duì)阿立哌唑血藥濃度的監(jiān)測和藥代動(dòng)力學(xué)的研究需要，本試驗(yàn)參考國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)［4-5］，建立了一種以乙醚 +二氯甲烷為提取劑測定人體血漿中阿立哌唑濃度的反相高效液相法(RP-HPLC)，并將其成功運(yùn)用于臨床，以期為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀(北京科瑞?？茖W(xué)儀器有限公司)，UV3000可變波長紫外分光檢測器(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，7725i六通進(jìn)樣器、色譜工作站(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，離心機(jī)、超聲波發(fā)聲器、DG55高效液相色譜系統(tǒng)在線脫氣機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，柱溫箱(天津旗美公司科技有限公司)，旋渦混合器，微量進(jìn)樣器 25 μl。

1.2 試劑與試藥 色譜用甲醇、乙腈(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)、分析用二氯甲烷、乙醚、凈化的超純水、市售分析純;阿立哌唑片(規(guī)格:10 mg/片，成都大西南制藥公司)、阿立哌唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品鑒定所，批號(hào):100776-200501，純度99．8%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱 C18(4．6 mm×250 mm，5 μm，迪馬公司)，檢測波長 257 nm，流動(dòng)相為乙腈－甲醇，以冰醋酸 pH值調(diào)至 6．3，用前經(jīng)0．45 μm微孔濾膜過濾并超聲波脫氣，流速1 ml/min，柱溫 35℃，進(jìn)樣量 15 μl，量程為 0．02 全方位吸光度單位(AUFS)，外標(biāo)法定量，阿立哌唑保留時(shí)間為5．567 min，樣品測定不受干擾(圖1)。

圖1 阿立哌唑反相高效液相色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液配制 精密稱取阿立哌唑?qū)φ掌?0 mg置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為儲(chǔ)備液，濃度1 mg/ml，再將對(duì)照品儲(chǔ)備液分別加甲醇稀釋至 40、30、25、20、15、10、5、2．5 和1．25 μg/ml作為系列工作液，置4℃冰箱中保存，使用時(shí)用甲醇稀釋至所需濃度。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取空白血漿0．9 ml分別加入阿立哌唑不同濃度的對(duì)照工作液適量，使血漿中阿立哌唑濃度分別為 5、25、50、100、200、300、600、800 ng/ml，然后加 2 mol/L NaOH 100 μl堿化混勻，加乙醚和二氯甲烷共3 ml，渦旋混合4 min，然后以轉(zhuǎn)速3000 r/min離心10 min。準(zhǔn)確吸取乙醚、二氯甲烷層移入另一離心管中，于50～60℃水浴中氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物以甲?0 μl充分復(fù)溶混勻，高速離心后取15 μl進(jìn)樣分析。以峰面積X對(duì)應(yīng)其濃度Y，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=268．3X+30．2(r=0．9967)。結(jié)果顯示，阿立哌唑在5～800 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測濃度為5 ng/ml。

2.4 精密度和方法回收率 配制含阿立哌唑高、中、低3種不同濃度的血漿樣本各5份，按“2．3”項(xiàng)下方法處理，分別做日內(nèi)及日間試驗(yàn)，計(jì)算日內(nèi)及日間的精密度(RSD)和方法回收率，見表1。

表1 精神分裂癥患者血漿阿立哌唑精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取空白血漿配制的含300 ng/ml樣品 1．0 ml，按“2．3”項(xiàng)下方法處理，測定阿立哌唑濃度，重復(fù)進(jìn)樣5次，含量的RSD=1．96%，說明本法的重復(fù)性良好。

2.6 干擾試驗(yàn) 為了確保血樣測定的可靠性，對(duì)臨床常用的抗精神病藥物分別配制成50和300 ng/ml的溶液，上述色譜條件下進(jìn)樣15 μl，進(jìn)行色譜分析，結(jié)果:氯氮平保留時(shí)間12．966 min，利培酮保留時(shí)間8．906 min，奮乃靜保留時(shí)間 13．546 min，對(duì)阿立哌唑均無明顯干擾。

2.7 血藥濃度檢測

2.7.1 診斷標(biāo)準(zhǔn):本實(shí)驗(yàn)室自2011年12月建立本方法以來，檢測阿立哌唑血藥濃度樣本34例，患者診斷均符合中國精神疾病分類方案和診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版(CCMD-3)精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。均為長期服藥者，其中男20例，平均年齡(38±15)歲;女14例，平均年齡(27±12)歲;病程(11±6)個(gè)月。血、尿常規(guī)及肝腎功能等實(shí)驗(yàn)室檢查正常，無嚴(yán)重器質(zhì)性疾病。

2.7.2 服藥劑量:口服1次10～15 mg，2/d，服藥期間均未服用其他抗精神分裂癥藥物。

2.7.3 采血時(shí)間:于服藥2周后晨時(shí)采集靜脈血5．0 ml，分離血漿，按“2．3”項(xiàng)下方法處理樣本并進(jìn)行測定。

2.7.4 血藥濃度測定結(jié)果:測得患者阿立哌唑平均血藥濃度為(371．2 ±36．6)ng/ml。

2.8 靈敏度 當(dāng)信噪比≥2(S/N≥2)時(shí)，阿立哌唑的最低檢出量為5 ng/ml，可滿足監(jiān)測要求。

3 討論

本研究建立了測定阿立哌唑血藥濃度的RPHPLC法。在選擇測定波長時(shí)，因阿立哌唑結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)苯環(huán)，具有共軛體系，故有明顯的紫外吸收。本試驗(yàn)以甲醇為空白，在200～300 nm波長范圍內(nèi)對(duì)阿立哌唑?qū)φ找哼M(jìn)行最大吸收波長紫外掃描，發(fā)現(xiàn)在220 nm和257 nm處均有最大吸收峰，但220 nm接近與末端吸收，噪聲較大，257 nm波長處吸收更靈敏，吸收值更大，故選擇257 nm作為測定波長，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。另外，因阿立哌唑在甲醇中溶解度較小，為了增加阿立哌唑的溶解度，在配制濃度較大的儲(chǔ)備液時(shí)加醋酸溶液0．5 ml［7］。

在流動(dòng)相選擇上，先以甲醇－水－乙腈作為流動(dòng)相，通過對(duì)流動(dòng)相中各成分不同配比研究發(fā)現(xiàn)，為使阿立哌唑縮短保留時(shí)間，峰形良好，達(dá)到好的分離效果，對(duì)流動(dòng)相不同成分之間的配比進(jìn)行了改進(jìn)，將甲醇－水－乙腈系統(tǒng)改為甲醇－乙腈系統(tǒng)，并適量加入正丁胺和冰醋酸調(diào)節(jié)pH值。本研究發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相pH值為6．3時(shí)，阿立哌唑分離良好，兼顧保留時(shí)間、分離度及峰形，故選擇流動(dòng)相中的甲醇為59．5%。

樣品制備方面，阿立哌唑在堿性條件下才能被有機(jī)溶劑萃取，所以在樣品預(yù)處理中加入強(qiáng)堿(0．1 mol/L的 NaOH)，以使信號(hào)穩(wěn)定，利于測定。試驗(yàn)中曾單用乙醚進(jìn)行萃取，發(fā)現(xiàn)萃取率較低。阿立哌唑易溶于二氯甲烷［8］，故使用乙醚+二氯甲烷(80∶20)進(jìn)行混合萃取，萃取率高，重現(xiàn)性好，且復(fù)溶后所含雜質(zhì)較少，不影響測定。

RSD日間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各批次樣本保留時(shí)間稍有差異，但均在保留時(shí)間的±1．1%以內(nèi)，RSD均在允許范圍的±5%以內(nèi)［9］，此漂移差異可能由于流動(dòng)相組分、柱溫及啟動(dòng)分析時(shí)間等的輕微變化所致。

阿立哌唑口服吸收迅速，3～5 h達(dá)到最高血藥濃度(Cmax)，食物不影響阿立哌唑最高血藥濃度［10］。在2～30 mg的劑量范圍內(nèi)，阿立哌唑的血藥濃度與劑量呈線性關(guān)系［11］。本研究結(jié)果顯示，口服阿立哌唑片的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)符合二房室模型，被測患者阿立哌唑的平均血藥濃度為(371．2±36.6)ng/ml，與張國陽等［8］的研究結(jié)果基本一致。本研究方法樣品預(yù)處理過程較簡單，干擾少，色譜保留時(shí)間短，縮短了分析時(shí)間，節(jié)約了流動(dòng)相，靈敏度高。該方法靈敏、準(zhǔn)確、專一性強(qiáng)，可滿足臨床進(jìn)行治療時(shí)藥物監(jiān)測和藥效學(xué)研究的要求。

［1］ 張曉紅，白延．簡述新型抗精神病藥阿立哌唑［J］．四川精神衛(wèi)生，2006，19(4):258-259．

［2］ 國效峰，趙靖平，陳晉東，等．阿立哌唑治療精神分裂癥療效及安全性的Meta分析［J］．中國神經(jīng)精神疾病雜志，2007，33(12):752-755．

［3］ Kubo M，Mizooku Y，Hirao Y，et al．Development and validation of an LC-MS/MS method for the quantitative determination of aripiprazole and its main metabolite，OPC-14857，in human plasma［J］．J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2005，822(1-2):294-299．

［4］ Lancelin F，Djebrani K，Tabaouti K．Development and validation of a high-performance liquid chromatography method using diode array detection for the simultaneous quantification of aripiprazole and dehydro-aripiprazole in human plasma［J］．J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008，867(1):15-19．

［5］ 黃璞，陳清霞，黃偉橋，等．高效液相色譜法同時(shí)測定人血漿中氯氮平、阿立哌唑濃度［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(15):1339-1340．

［6］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)精神分會(huì)．中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)［M］．3版．濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社，2001:75-82．

［7］ 蔣曄，田書霞，賈湘曼，等．高效液相色譜法測定阿立哌唑的含量［J］．藥物分析雜志，2005，25(7):835-837．

［8］ 張國陽，王利．反相高效液相色譜法測定阿立哌唑血藥濃度［J］．藥學(xué)與臨床研究，2007，15(5):374-376．

［9］ 馬劍文，韓永平，沈克溫．現(xiàn)代藥品檢驗(yàn)學(xué)［M］．北京:人民軍醫(yī)出版社，1994:458．

［10］ 劉偉忠，黃偉僑，黎曙霞，等．高效液相色譜法測定人血漿中阿立哌唑濃度［J］．中國藥房，2007，18(2):111-113．

［11］ 左笑叢，劉世坤，朱運(yùn)貴，等．阿立哌唑的血藥濃度與其治療精神分裂癥療效的相關(guān)性分析［J］．中國新藥與臨床雜志，2006，25(8):601-605．

［12］ 張國陽，王利．反相高效液相色譜法測定阿立哌唑血藥濃度［J］．藥學(xué)與臨床研究，2007，15(5):374-376．