楊國良，鄭 杰，張 洪，龍進學(xué)，張發(fā)明，張 坦，孫豐廷，鄧秋紅，張 紅，王文泉

(北京華都詩華生物制品有限公司，北京 102600)

雞傳染性鼻炎(Infectious Coryza，IC)是由副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)引起雞的一種急性呼吸道疾病，該病可使育成雞生長發(fā)育不良和產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋明顯下降(可引起產(chǎn)蛋率下降10% ～40%)［1］。在我國主要發(fā)生在北京、西安等一些北方的養(yǎng)殖場，在南方很少有報道［2］。其主要特征是發(fā)病率高而死亡率低，但飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、寄生蟲、營養(yǎng)不良或伴發(fā)其他疾病，如禽痘、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎等，可使傳染性鼻炎的病情加重，持續(xù)時間會更長，引起死亡率增加［3－4］。由于康復(fù)的帶菌雞是主要的傳染源，所以不提倡從不明來源的地方購買種公雞和開產(chǎn)雞的習(xí)慣做法，除非知道雞群來源于無傳染性鼻炎雞場，否則只應(yīng)購買1日齡雞作為后備雞。預(yù)防和控制本病的理想措施是遠離老雞群進行隔離飼養(yǎng)。要從雞場中徹底消除病原，必須首先清除感染雞或康復(fù)雞，對禽舍和設(shè)備進行清洗和消毒后，在重新飼養(yǎng)清潔雞之前，禽舍應(yīng)空閑2～3周。

按照Page平板凝集試驗的分型方法，副雞禽桿菌可分為A、B和C三個血清型。各型之間不產(chǎn)生交叉保護［5］，一種血清型制備的菌苗免疫雞，只能對同源菌的攻擊提供保護。2003年張培君等在遼寧首次分離到了B型副雞禽桿菌［6］，結(jié)合本次北京所分離到的2株B型副雞禽桿菌，說明我國B型Apg的存在已經(jīng)不局限于某地的暴發(fā)，而是有蔓延的趨勢。這就要求現(xiàn)階段養(yǎng)殖戶在免疫時有必要將傳染性鼻炎疫苗與目標雞群中存在的血清型相匹配，這樣才能達到最理想的免疫效果，從而防止蔓延。基于此，我國應(yīng)該積極研制B型副雞禽桿菌的單苗或聯(lián)苗，以打破國內(nèi)以A型、C型單雙價滅活疫苗為主的格局。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 標準菌株 C－Apg－8(Page A型)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1．1．2 鼻炎疫苗 雞傳染性鼻炎(A型)滅活疫苗由北京華都詩華生物制品有限公司提供。

1．1．3 培養(yǎng)基 雞肉湯培養(yǎng)基、雞肉湯瓊脂、半合成培養(yǎng)基參照馮文達等的方法制備［7］。

1．1．4 主要試劑及試劑盒 DNA Marker、DNA聚合酶、dNTPs，TaKaRa公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純，均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

1．1．5 病料信息 病雞來源于北京平谷和延慶某公司雞場，具有雞傳染性鼻炎的臨床癥狀。主要表現(xiàn)為臉部腫脹，鼻孔有粘性分泌物流出，有時打噴嚏，食欲及飲水減少，體重減輕，精神沉郁，縮頭，呆立。6 d內(nèi)蔓延全群，85%的雞出現(xiàn)癥狀。

1．2 方法

1．2．1 菌株分離 將具有典型臨床癥狀的病雞處死，雞頭表面消毒，無菌切開眶下竇，用接種環(huán)蘸取眶下竇內(nèi)容物，在含有NAD(輔酶Ⅰ、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的雞血清瓊脂平板上劃線，同時接種普通肉湯和普通瓊脂平板作為對照，然后將平皿倒置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～20 h，挑取單個可疑菌落進行純培養(yǎng)，同時將純培養(yǎng)產(chǎn)物作為研究對象，進行下一步鑒定。

1．2．2 無雜菌檢驗 將北京平谷、延慶所分離的可疑菌落純培養(yǎng)物接種葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨瓊脂(GA)斜面、硫乙醇酸鹽(TG)小管各2支，每支0．2 mL，其中1支置37℃培養(yǎng)，1支置25℃培養(yǎng)，觀察3～5 d。

1．2．3 過氧化氫酶試驗 挑取典型的菌落進行過氧化氫酶試驗，如有氣泡即為陽性反應(yīng)。

1．2．4 種子液活菌計數(shù)方法 采用微量點板計數(shù)法。選擇適宜的四個稀釋度，每個稀釋度接種2點，接種量為10μL，接種含有NAD的雞血清瓊脂平板使其自然擴散。于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h(37℃、5%CO2)。依照 GB4789．2－94中的方法開展活菌計數(shù)。

1．2．5 PCR鑒定方法 按常規(guī)方法處理細菌培養(yǎng)物，將上述培養(yǎng)物取2μL作為模板，進行 PCR。PCR程序參照陳小玲等的方法進行:98℃變性2．5 min。反應(yīng)過程為94℃ 1 min，65℃ 1 min和72℃2 min，循環(huán)25次，然后94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 10 min循環(huán)1次。PCR產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳分析［8］。

1．2．6 引物合成 根據(jù)陳小玲等發(fā)表文章中已知的引物序列［9］，由Invitrogen北京分公司合成。上游引物P1:5’－TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT－3’;下游引物 P2:5’－ CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT －3’。

1．2．7 回歸試驗 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的新鮮菌液，經(jīng)過活菌計數(shù)并且將其稀釋至規(guī)程要求的范圍，眶下竇接種70日齡的SPF雞，其中試驗組和對照組分3個隔離器飼養(yǎng)，接種后逐日觀察其臨床表現(xiàn)。試驗情況見表1。

表1 攻毒情況記錄表

1．2．8 免疫攻毒試驗 取60～90日齡SPF雞28只，其中免疫組、對照組在分別接種A型鼻炎疫苗、PBS 30 d后各眶下竇內(nèi)注射平谷株、延慶株以及A型細菌培養(yǎng)物，分5個隔離器飼養(yǎng)，觀察14 d，試驗情況見表2。

表2 免疫攻毒情況記錄表

1．2．9 水平傳播試驗 取60～90日齡SPF雞40只，其中6只一組(3只作為攻毒組，3只作為PBS對照組)，14只一組(3只作為攻毒組，11只作為PBS對照組)，分別放入飼養(yǎng)面積相同的1～4號隔離器中飼養(yǎng)。每組雞按要求各眶下竇內(nèi)接種平谷株、延慶株細菌培養(yǎng)物，接種后逐日觀察其臨床表現(xiàn)，試驗情況見表3。

表3 Apg水平傳播試驗記錄表

1．2．10 分離菌株血清型鑒定 將菌株用20%甘油保存，送匈牙利詩華研發(fā)中心代為鑒定。

1．2．11 序列測定與分析 從瓊脂糖中回收PCR產(chǎn)物目的片段，用雙脫氧法直接對PCR產(chǎn)物進行測序，為了保證序列準確性，同時反向測定序列加以驗證。并將所測定的2株B型副雞禽桿菌基因序列與NCBI基因庫中參考株(GenBank登錄號:DQ132874．1)相應(yīng)序列進行比較分析。

2 結(jié)果

2．1 細菌分離及初步鑒定 從平谷、延慶可疑病雞眶下竇內(nèi)各分離到1株細菌，此菌在含有NAD的雞血清瓊脂平板上形成邊緣整齊、半透明露滴狀的小菌落，在普通肉湯和普通瓊脂平皿上不生長。挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡下可見兩級濃染的革蘭氏陰性短桿菌。過氧化氫酶試驗結(jié)果均為陰性，無雜菌檢驗顯示葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨瓊脂(GA)斜面上均無菌生長，硫乙醇酸鹽(TG)小管有輕微細菌生長。

2．2 PCR反應(yīng)結(jié)果 如圖1所示，平谷、延慶菌株與標準陽性對照菌株、陰性對照一起，經(jīng)PCR儀按照設(shè)定程序擴增后，經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳25 min，結(jié)果顯示分離菌株與標準陽性對照菌株均在0．5 kb位置出現(xiàn)了大小相同的DNA條帶，與預(yù)期的擴增片段大小一致。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結(jié)果

2．3 回歸試驗 用平谷、延慶分離菌株人工感染SPF雞24 h后均出現(xiàn)食欲減退、眶下竇及臉部嚴重腫脹、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC臨床發(fā)病癥狀。在感染雞的眶下竇內(nèi)又重新分離到了副雞禽桿菌菌落。剖檢病變主要為兩側(cè)眶下竇內(nèi)有粘液樣物質(zhì)分泌，眼結(jié)膜充血。接種PBS的對照雞，至觀察結(jié)束未出現(xiàn)IC發(fā)病癥狀。

2．4 免疫攻毒試驗 副雞禽桿菌平谷株對照組4/4發(fā)病，免疫組1/8保護為不合格;延慶株對照組4/4發(fā)病，免疫組0/8保護為不合格(根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》:對照組4/4發(fā)病，免疫組6/8保護為合格。對照組3/4發(fā)病，免疫組7/8保護為合格)。而接種A型疫苗+A型菌液的對照組100%保護(4/4)。

2．5 水平傳播試驗 1、3號隔離器中的攻毒組3/3發(fā)病，對照組至觀察結(jié)束未見IC發(fā)病癥狀。2、4號隔離器中的攻毒組3/3發(fā)病，對照組在攻毒后第5天相繼出現(xiàn)了食欲減退、臉部腫脹、流鼻涕、打噴嚏等IC發(fā)病跡象。隨后對2、4號隔離器中對照組雞進行細菌的分離培養(yǎng)及PCR檢測鑒定，證明所分離到的菌株為副雞禽桿菌。

2．6 血清型鑒定結(jié)果 將所分離到的平谷株、延慶株Apg經(jīng)匈牙利詩華研發(fā)中心代為鑒定，其結(jié)果為B型副雞禽桿菌。

2．7 序列測定與分析結(jié)果 經(jīng)序列測定，克隆的PCR產(chǎn)物長度為500 bp，與預(yù)期的擴增片段長度相符。應(yīng)用DNASTAR軟件進行基因核苷酸序列遺傳距離分析，結(jié)果顯示平谷株、延慶株基因序列同源性達到99．6%，而與 NCBI基因庫中參考株(GenBank登錄號:DQ132874．1)Modesto的基因序列同源性達到98．3%、98．8%，結(jié)果見圖2。

圖2 B型副雞禽桿菌基因核苷酸序列遺傳距離分析結(jié)果

3 討論

3．1 本試驗中分離菌在含NAD的雞血清瓊脂平皿上呈露滴狀生長，在普通肉湯和普通瓊脂平皿上不生長;革蘭氏染色為陰性短桿菌，兩極濃染;過氧化氫酶試驗結(jié)果為陰性;無雜菌檢驗顯示在GA、GP上均無菌生長，但在TG小管中有輕微細菌生長;將分離菌人工感染SPF雞24 h后均出現(xiàn)眶下竇及臉部嚴重腫脹、食欲減退、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC臨床發(fā)病癥狀，同時在感染雞的眶下竇內(nèi)又重新分離到了副雞禽桿菌;在PCR結(jié)果陽性的基礎(chǔ)上，用已知Apg A型鼻炎滅活疫苗免疫SPF雞后接種平谷、延慶分離菌株，均不能保護，而接種A型菌株的對照組100%保護(4/4)證明所分離到的Apg肯定不是A型。為了進一步驗證分離物，將分離到的Apg送匈牙利詩華研發(fā)中心代為鑒定。鑒定結(jié)果與攻毒保護試驗結(jié)果一致，可以判定該分離物為B型副雞禽桿菌，暫命名為副雞禽桿菌平谷株和延慶株。

3．2 雞傳染性鼻炎傳播途徑主要以飛沫及塵埃經(jīng)呼吸傳播，本次傳播試驗中，使用相同面積飼養(yǎng)的1、3號隔離器內(nèi)的6只雞沒有發(fā)生水平傳播現(xiàn)象，而2、4號隔離器內(nèi)的14只雞在攻毒后第5天相繼出現(xiàn)了精神沉郁、食欲減退、鼻孔有粘性分泌物流出、臉部腫脹、打噴嚏、縮頭、呆立等IC發(fā)病跡象。由此可見，本病的發(fā)生和反復(fù)發(fā)作與飼養(yǎng)密度有很大的關(guān)系。

3．3 由免疫攻毒試驗得知，傳染性鼻炎A型滅活疫苗免疫過的SPF雞對平谷、延慶分離菌株的攻擊沒有起到保護作用，此結(jié)果與該菌株的血清型的鑒定結(jié)論一致。由于滅活的雞傳染性鼻炎疫苗只提供針對疫苗中含有的Page血清型的保護，因此菌苗中關(guān)鍵要含有目標雞群中存在的血清型。Page B型已經(jīng)證實是一種真正存在的具有完全致病性的血清型，并且發(fā)生很廣，這就是說，在存在血清型B的地區(qū)使用的滅活菌苗中必須含有這一血清型。然而，由于血清型B的不同菌株間只能提供部分交叉保護［10］，因此在血清型B流行的地區(qū)有必要加快雞傳染性鼻炎多價疫苗的研究。

［1］ Blackal P J，Matsumoto M，Yamamoto R．Infectious coryza［C］．In B．W．Calnek，H．J．Barnes，C．W．Beard，et al(Eds)，Diseases of poultry 10thedn(pp179 ～190)，Ames:lowa State University Press，1997．

［2］ 羅廷榮，艾博特，梁家權(quán)，等．二株副雞嗜血桿菌分離株的生物學(xué)特性鑒定［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22(3):170－173．

［3］ Sandoval V E，Terzolo H R，Blackall P J．Complicated infectious coryza cases in Argentina［J］．Auian Dis，1994，38:672 －678．

［4］ Yamamoto R．Infectious Coryza．In M SHofstad，BW Calnek，C F Helmboldt，W M Reid，and HW Yoder，Jr．(eds．)［M］．Diseases of Poultry，6th ed．Ames:Iowa State University Press，1972:272－281．

［5］ BW卡爾尼克．禽病學(xué)(第10版)［M］．高 福，蘇敬良，譯．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1999:218－227．

［6］ Zhang P J，Miao D Y，Sun H L，et al．Infectious coryza due to Haemophilus paragallinarum serovar B in China［J］．Australian Vererinary Journal，2003，(81):96 －97．

［7］ 馮文達．北京雞傳染性鼻炎病原菌的分離鑒定［J］．微生物學(xué)通報，1987，5:216 －219．

［8］ Chen X，Miflin JK，Zhang P，et al．Development and application of DNA probes and PCR tests for Haemophilus paragallinarum［J］．Avian Dis，1996，40(2):398 － 407．

［9］ 陳小玲，Miflin JK，張培君，etal．副雞嗜血桿菌PCR試驗及應(yīng)用［J］．中國獸藥雜志，1996，30(1):4 －6．

［10］ Yamaguchi T，Blackall P J，Takigami S，et al．Immunogenicity of Haemophilus paragallinarum serovar B strains［J］．Avian Dis，1991，35:965 －968．