陳偉強，魏鳳香，潘德順，辛 華，王 莉，王 琳

（1.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州510006；2.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院中心實驗室，廣東 深圳518000；3.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東 廣州510006；4.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003）

腎臟系膜細(xì)胞（MCs）過度增殖而導(dǎo)致腎小球硬化（GS），引起腎單位結(jié)構(gòu)和功能破壞，最終發(fā)展為慢性腎衰竭。GS是多種生物活性物質(zhì)和細(xì)胞成分參與的復(fù)雜過程，腎臟局部和機體系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境改變都可以影響其發(fā)生發(fā)展，其中MCs在炎癥的剌激下過度增殖是其主要病理基礎(chǔ)[1]。脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，為重要的炎癥反應(yīng)觸發(fā)劑，并誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。FoxM1B屬于叉頭框（forkhead box，F(xiàn)ox）蛋白家族成員之一，是與細(xì)胞增殖有關(guān)的特異性轉(zhuǎn)錄因子。LPS可刺激腎臟系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)合成，但其作用是否與FoxM1B表達(dá)變化相關(guān)，目前不十分清楚。本實驗通過脂多糖（LPS）模擬炎癥過程，觀察腎小球系膜細(xì)胞增殖、FoxM1B分子表達(dá)的變化，以探討LPS誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞增生的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

脂多糖（LPS，Sigma公司）；RPMI一1640、Trizol RNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自Amresco公司。新生小牛血清（FCS）為杭州四季青生物工程材料研究所提供。

1.2 系膜細(xì)胞培養(yǎng)

以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，于37℃、飽和濕度下、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長，2～3d傳代一次。取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 實驗分組

①對照組，細(xì)胞不作任何處理；②LPS（10μg／mL）處理12h組；③LPS（10μg／mL）處理24h組；④LPS（10μg／mL）處理48h組。

1.4 細(xì)胞增殖水平檢測

取培養(yǎng)系膜細(xì)胞胰蛋白酶消化，加RPMI－1640完全培養(yǎng)液于離心管中，吹打混勻，按每孔200μL，密度103／mL接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁24h后，換5%血清培養(yǎng)液200μL，同步24h。再按上述分組孵育，刺激時間為12、24、48h。置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，加人噻唑藍(lán)（MTT），于4h后分別加人二甲基亞礬（DMSO），酶標(biāo)儀620nm波長處記錄吸光度值（D值）。

1.5 qRT－PCR法檢測不同細(xì)胞處理組FoxM1BmRNA含量

不同處理組系膜細(xì)胞，加入TRIzol試劑裂解提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo（dT）將總RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。反應(yīng)條件：42℃20min、99℃5min、4℃5min。以cDNA作為模板通過qRT—PCR法檢測細(xì)胞中FoxM1BmRNA的含量，反應(yīng)條件：95℃3min、95℃30S、65℃30S、72℃30S；擴增45個循環(huán)。以β－肌動蛋白作為內(nèi)參，用ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。FoxM1B及β－肌動蛋白熒光定量PCR引物由本室設(shè)計。并由上海生物工程有限公司合成。FoxM1B上游引物：5’ATGAAAACTACCCCCGTC3’，下游引物：5’TGGGGTGGTTAATAACTTGG3’。β－肌動蛋白上游引物：5’CCAGC－CTTCCTTCTTGGGTAT3’，下 游 引 物：5’TTGGCATAGAGGTCTTACGG 37。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）檢測

細(xì)胞處理后，用0.5%胰蛋白酶消化，4℃PBS漂洗3次，加入600μL細(xì)胞裂解液（2×106個細(xì)胞，內(nèi)含磷酸酶抑制劑），置冰上30min后，4℃、15000×g離心30min，上清液即為總的細(xì)胞蛋白溶解成分。上清液加等量2倍十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液在十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)膜到醋酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，以兔抗人（1：5000）為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1：500）為二抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，發(fā)光試劑盒顯色。Alphalmager2200圖像系統(tǒng)分析灰度值，取β－肌動蛋白灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析[2]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的結(jié)果

用MTT方法檢測。與對照組相比，在12、24、48h，10μg／mL的LPS能促進(jìn)MCs增殖。結(jié)果見表1。

表1 LPS誘導(dǎo)的MCs增生（±s，n＝10）

表1 LPS誘導(dǎo)的MCs增生（±s，n＝10）

注：＊與正常對照組比較，P＜0.05。

組 別 12h 24h 0.27±0.02 0.31±0.04 0.38±0.03 LPS組 0.39±0.02＊ 0.48±0.03＊ 0.64±0.0448h正常對照組＊

2.2 兩組細(xì)胞FoxM1BmRNA的水平

采用qRT－PCR法檢測兩組細(xì)胞FoxM1BmRNA的含量.以對照組mRNA水平為基礎(chǔ)，LPS處理組mRNA水平用對照組的倍數(shù)來表示；結(jié)果顯示：LPS處理細(xì)胞FoxM1B mRNA水平明顯高于對照組（P＜0.001）。結(jié)果見圖1。

圖1 對照組和LPS處理組細(xì)胞FoxM1BmRNA水平

2.3 LPS對人系膜細(xì)胞FoxM1B蛋白表達(dá)的影響

FoxM1B和β－肌動蛋白灰度值的比值見表2、圖2。

表2 LPS對MCs FoxM1B表達(dá)的影響（±s，n＝10）

表2 LPS對MCs FoxM1B表達(dá)的影響（±s，n＝10）

注：＊與正常對照組比較，P＜0.01。

組別 12h 24h 0.13±0.01 0.17±0.02 0.16±0.02 LPS組（FoxM1B／β－actin） 0.45±0.02＊ 0.63±0.03＊ 0.74±0.0448h正常對照組（FoxM1B／β－actin）＊

圖2 LPS對MCs FoxM1B表達(dá)的影響

3 討論

腎小球內(nèi)MC增生和細(xì)胞外基質(zhì)增多是多種腎小球疾病、腎小球毀損、硬化過程中的主要表現(xiàn)[3]。MC屬于血管周細(xì)胞，是反應(yīng)活躍的腎小球固有細(xì)胞，在炎癥過程中不但是被動受害者，而且是直接參與者。我們發(fā)現(xiàn)：LPS能明顯誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的增殖，這與以前的報道是一致，目前認(rèn)為：其作用機制與LPS調(diào)節(jié)多種炎癥和細(xì)胞生長因子相關(guān)[4]。叉頭框（forkhead box，F(xiàn)ox）蛋白家族是一類DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)17個亞族。Foxm1屬Fox轉(zhuǎn)錄因子的一個亞型，根據(jù)轉(zhuǎn)錄后不同的剪切形式又分為A、B、C三個亞型。其中FoxM1B與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。FoxM1B可見于所有胚胎組織及正在擴增的細(xì)胞中，終末分化細(xì)胞及靜止期細(xì)胞中幾乎沒有表達(dá)，但是當(dāng)靜止期細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期時則又恢復(fù)高水平表達(dá)。成年組織中僅在胸腺及睪丸中高表達(dá)（由于此兩種器官中存在活躍的細(xì)胞增殖過程），在正常肝臟中的表達(dá)水平很低，若部分切除肝臟后，由于殘留肝細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期，其表達(dá)水平又可見明顯增加，此外在許多腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)。因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為FoxM1B是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的特異性轉(zhuǎn)錄因子。FoxM1B的表達(dá)受c－Myc和核轉(zhuǎn)錄因子E2F的調(diào)控。細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂前c－Myc和E2F表達(dá)增高，二者可以結(jié)合在FoxM1b啟動子區(qū)，上調(diào)FoxM1B的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。研究證實FoxM1B的表達(dá)水平及其活性在G1末期即明顯升高，且一直持續(xù)到有絲分裂完成。FoxM1B通過調(diào)控下游靶基因促進(jìn)細(xì)胞分裂，目前已發(fā)現(xiàn)的20多個FoxM1B靶基因幾乎都與細(xì)胞周期及分裂增殖有關(guān)，如FoxM1B可以促進(jìn)cyclins和CDKs的表達(dá)。同時，cyclins及CDKs又可促進(jìn)FoxM1B的磷酸化水平，一方面增強其轉(zhuǎn)錄活性，另一方面有助于其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移[3]。我們研究發(fā)現(xiàn)：正常培養(yǎng)的系膜細(xì)胞僅能表達(dá)極微量FoxM1b，這與其它的研究結(jié)果是一致的，而LPS在誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增生同時，能明顯誘導(dǎo)FoxM1b表達(dá)增加，表明FoxM1B與LPS誘導(dǎo)的MCs增殖可能有關(guān)；但其詳細(xì)的作用機制需要進(jìn)一步的實驗加以探討。我們的研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步確認(rèn)FoxM1B在MCs過度增殖從而引發(fā)腎小球硬化及腎單位損害中的作用，為延緩乃至阻止腎單位的進(jìn)行性破壞提供新的生物治療靶點。

[1]Picken MM.The role of mesangial homeostasis in glomerular injury progression：hope for mesangial sclerosis reversal[J].Kidney Int，2009，5（6）：574－576

[2]潘德順，陳偉強.苯丁酸鈉對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株p21和survivin基因表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2010－02－20

[3]Wang JL，Cheng HF.A selective cyclooxygenase－2inhibitor decreases protein uria and retards progressive renal injury in rats[J].Kidney International，2000，57（6）：2334－2342

[4]Lee IT，Shih RH，Lin CC，et al.Role of TLR4／NADPH oxidase／ROS－activated p38MAPK in VCAM－1expression induced by lipopolysaccharide in human renal mesangial cells[J].Cell Commun Signal，2012，10（1）：33－38