胡存利，王 超，牛文斌，郝 鵬，郭玉剛，曹會(huì)峰，遲寶進(jìn)

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯154003；2.夷陵醫(yī)院，湖北 宜昌443100）

隨著我國人均壽命的不斷增長與生活水平的逐步提高，近年來前列腺癌的發(fā)病率出現(xiàn)快速上升，故早期診斷和治療以提高前列腺癌的治愈率值得高度重視。直腸指診（digital rectal examination，DRE）、經(jīng)直腸超聲檢查（transrectal ultrasonography，TRUS）和PSA測定等是目前前列腺癌診斷的重要手段，確診主要依靠前列腺穿刺活檢或病理。隨著研究的日益深入，利用PSA篩查前列腺癌的價(jià)值遭到廣泛質(zhì)疑，而前列腺穿刺活檢又會(huì)造成一定的創(chuàng)傷，且可能會(huì)并發(fā)感染、出血、血管迷走神經(jīng)反射及腫瘤種植等。故臨床上急需診斷前列腺癌更好、更準(zhǔn)確的手段，以減輕患者的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。EPCA－2是一種與前列腺癌相關(guān)的核基質(zhì)蛋白，有研究表明它能較病理切片提早5年或更多時(shí)間準(zhǔn)確的診斷出前列腺癌[1]。PCA3是近幾年來所發(fā)現(xiàn)的一種最佳的前列腺癌特異基因，其表達(dá)僅在前列腺上皮細(xì)胞，且具有腫瘤特異性。為了探討血清EPCA－2聯(lián)合尿液PCA－3檢測在前列腺癌診斷中的臨床意義，本研究采用ELISA檢測前列腺癌患者血清EPCA－2的水平，同時(shí)采用RT－PCR檢測前列腺癌患者尿液PCA3基因表達(dá)情況。并探討二者的變化在前列腺癌診斷中是否具有協(xié)同效應(yīng)，從而為前列腺癌的早期診斷提供更好的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本

2010－03～2012－12收治的BPH患者38例，年齡59～84歲，平均（71.0±6.6）歲，同期收治的前列腺癌患者26例，年齡56～83歲，平均（72.8±7.5）歲。兩組患者在年齡、性別和病史等方面沒有明顯差異，具有可比性。所有患者均經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)后病理確診。健康體檢者標(biāo)本來自我院體檢中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

所有病例均為入院第2天清晨空腹采血，采血前一周內(nèi)未行導(dǎo)尿、DRE、前列腺按摩、TRUS及膀胱鏡檢查等，且一個(gè)月內(nèi)未行前列腺穿刺，并排除入院前合并有急、慢性前列腺炎與急性尿潴留的患者，以最大限度減低可能干擾血清EPCA－2濃度的因素。血液采集以后，3000轉(zhuǎn)離心10min將血清和紅細(xì)胞快速仔細(xì)地分離，然后將血清用移液器移至EP管內(nèi)待檢。標(biāo)本如果無法立即檢測可以保存于－20℃冰箱中。采用EPCA－2酶聯(lián)免疫試劑盒（美國R＆B公司生產(chǎn)）分別檢測三組患者血清EPCA－2水平。所用酶標(biāo)儀為芬蘭Labsystems Multiskan MS 352型。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。以EPCA－2＞30ng／mL為前列腺癌的判定標(biāo)準(zhǔn)。尿液PCA－3的提取分為兩個(gè)步驟：（1）總RNA的提?。喝∏傲邢侔茨蟮牡谝淮文蛞?0mL，立即放入冰中冷卻。于3000rpm／10min離心收集尿沉渣，加等量冷D－h(huán)anks液洗滌兩次，放置在－70℃保存?zhèn)溆茫唇?jīng)典總RNA抽屜試劑盒說明書上提取總RNA后真空干燥，用15mL DEPC溶解，取2μL RNA溶液加入98μL水中，混勻后在微量分光光度計(jì)上測A260／A280比值及RNA含量。（2）RT－PCR檢測：先合成cDNA，取11μL RNA模板樣品，加oligo180.5μg／μL，具體操作按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，總反應(yīng)體積約20μL，最后取2μL來PCR擴(kuò)增，在外顯子1和4之間設(shè)計(jì)一對(duì)PCA3引物，上游引物TGGGAAGGACCTGATGATACA＇，下游引物，CCCAGGGATCTCTGTGCTT。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察有無406bp目的產(chǎn)物[2，3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EPCA－2在正常對(duì)照組、前列腺癌組和BPH組測定結(jié)果

前列腺癌組患者血清EPCA－2水平為（56.32±16.96）ng／mL，明顯高于BPH組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 EPCA－2在正常對(duì)照組、PCa組和BPH組的水平（±s）

表1 EPCA－2在正常對(duì)照組、PCa組和BPH組的水平（±s）

組別 n EPCA－2（ng／mL）26 56.32±16.9610 9.02±1.46前列腺增生組 38 12.78±9.47前列腺癌組正常組

2.2 PCA－3在正常對(duì)照組、前列腺癌組和BPH組的表達(dá)情況

所有標(biāo)本中，僅前列腺癌患者中見到一特異406bpPCA3電泳帶，其中健康體檢者和前列腺增生患者無PCA3表達(dá)，前列腺癌患者中都表達(dá)PCA3mRNA。

表2 PCA－3在正常對(duì)照組、PCa組和BPH組的表達(dá)情況

3 討論

核基質(zhì)（nuclear matrix）是充盈于細(xì)胞核內(nèi)的一種三維蛋白網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而構(gòu)成核基質(zhì)主要成分的核基質(zhì)蛋白（nuclear matrix proteins，NMPs）對(duì)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)等方面都具有重要的調(diào)控功能，且具有組織細(xì)胞特異性及腫瘤相關(guān)性。研究表明，核基質(zhì)及核基質(zhì)蛋白的變化與各種組織（包括前列腺）的癌變有關(guān)[4]。因此，NMPs已被初步用于區(qū)分正常前列腺和前列腺癌。EPCA－2是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種在前列腺癌中表達(dá)而在正常前列腺不表達(dá)的NMPs。研究人員[5]通過免疫抗體測定患者血液中的EPCA－2水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)97%的未罹患前列腺癌的患者EPCA－2結(jié)果為陰性，無癥狀的男性和患有其它惡性腫瘤及良性疾病的患者EPCA－2含量小于臨界值，90%的局限性前列腺癌患者和98%浸潤性前列腺癌患者EPCA－2含量等于或大于臨界值?？傮w上94%的前列腺癌可以通過EPCA－2篩查出來。以上結(jié)果提示EPCA－2可以作為前列腺癌篩查的腫瘤標(biāo)記物。

本研究結(jié)果顯示，前列腺癌患者血清EPCA－2的水平為（56.32±16.96）ng／mL，明顯高于 BPH 組的（12.78±9.47）ng／mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。這提示EPCA－2與前列腺癌變存在聯(lián)系，EPCA－2的測定有利于前列腺癌的診斷與鑒別診斷。若以EPCA－2＞30ng／mL為前列腺癌的判定標(biāo)準(zhǔn)，其預(yù)測前列腺癌的特異性達(dá)91.2%，敏感性達(dá)95.4%。但是，在臨床上發(fā)現(xiàn)，EPCA－2在前列腺癌中診斷的特異性并非100%，可能會(huì)引起漏診，若同時(shí)檢測患者尿液PCA－3可以起到輔助診斷的作用。

PCA3基因是1999年bussemakers等[6]發(fā)現(xiàn)的一種前列腺癌特異基因，它是一種非編碼RNA。通過Northernblot法分析該基因特異性表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞，正常前列腺細(xì)胞，前列腺增生的細(xì)胞中不表達(dá)或者僅少量表達(dá)，在其他腫瘤組織中不表達(dá)。此外，2002年De KOK等[7]研究也得出PCA3在正常組織和良性前列腺增生組織中有非常少表達(dá)的結(jié)果。但是前列腺癌PSA基因的表達(dá)與前列腺增生組織相比無顯著差異。與PSA基因相比，PCA3基因是一個(gè)前列腺癌特異性很強(qiáng)的基因。本實(shí)驗(yàn)是建立在RT－PCR基礎(chǔ)上，檢測前列腺癌按摩后尿液PCA3基因的表達(dá)進(jìn)行分析。經(jīng)前列腺按摩后，前列腺細(xì)胞通過前列腺管進(jìn)入尿道。前段尿中含有前列腺細(xì)胞最多。由于不同的標(biāo)本中含有前列腺細(xì)胞數(shù)量不一樣，每微克RNA所含前列腺細(xì)胞的比例也不同，需要用管家基因?qū)ζ湫Ｕ?，本?shí)驗(yàn)選擇PSA作為管家基因，已經(jīng)證實(shí)PSA基因在正常前列腺細(xì)胞表達(dá)較恒定，在前列腺癌細(xì)胞中輕微下降。本實(shí)驗(yàn)對(duì)前列腺按摩后尿液PCA3基因定性分析結(jié)果顯示：前列腺癌患者尿液PCA3基因表達(dá)呈陽性，前列腺增生患者尿液PCA3基因表達(dá)為陰性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明尿液PCA3基因可以鑒別前列腺癌患者和非前列腺癌患者。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EPCA－2存在于前列腺腫瘤細(xì)胞中，表明EPCA－2檢測可以為前列腺癌早期診斷提供依據(jù)，同時(shí)也證實(shí)，在前列腺癌發(fā)生過程中，PCA－3表達(dá)也明顯增高。因此可以推斷，EPCA－2與PCA－3聯(lián)合檢測可以為前列腺癌的早期診斷提供依據(jù)，從而減少很多不必要的過度診斷和過度治療，降低患者的心理負(fù)擔(dān)和社會(huì)、經(jīng)濟(jì)成本。

[1]Dhir R，Vietmeier B，Arlotti J，et al.Early identification of individuals with prostate cancer in negative biopsies[J].J Urol，2004，171（4）：1419－1423

[2]羅振國，蒲永昌，王天喜.尿液PCA3基因檢測在前列腺癌診斷中的意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33（3）：58－59

[3]羅振國，王超，陶然，等.血清PSA、fPSA／tPSA在前列腺癌診斷中的臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012，35（1）：32－33

[4]Brunagel G，Schoen RE，Bauer AJ，et al.Nuclear matrix protein alterations associated with colon cancer metastasis to the liver[J].Clin Cancer Res，2002，8（10）：3039－3045

[5]Getzenberg，Leman ES，Cannon GW，et al.EPCA－2：A Highly Specific Serum Marker for Prostate Cancer[J].J Urol，2006，175（4）∶275－275

[6]Bussemakers MJ，Van BA，Verhaegh GW，et al.DD3：a new prostate－specific gene，highly overexpressed in prostate cancer[J].Cancer Res，1999，59：5975－5979

[7]de Kok JB，Verhaegh GW，Roelofs RW，et al.DD3（PCA3），a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors[J].Cancer Res，2002，62：2695－2698