任 杰，胡志和，劉 洋

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

牛初乳是母牛提供給新生牛犢用來(lái)抵抗外來(lái)微生物的一種乳品，其含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[1]，同樣富含免疫球蛋白、生長(zhǎng)因子等活性功能組分[2-3]，能消滅侵入人體的致病原[4]，抑制病菌繁殖，是一種能增強(qiáng)人體免疫力、促進(jìn)組織生長(zhǎng)的功能性健康食品[5-6]。大量研究證明，牛初乳是除人初乳外惟一富含生長(zhǎng)因子和免疫因子的天然食物，被認(rèn)為是替代人初乳的最佳乳品[7]。然而近年來(lái)，由于污染致病菌而引起的乳品中毒事件常有發(fā)生[8-9]，使得乳品安全問(wèn)題成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。尤其是存在于乳中的金黃色葡萄球菌是引起我國(guó)食物中毒的主要病原菌，它能殺死白細(xì)胞素，引起人的化膿性感染、肺炎、偽膜性、腸炎和膿毒血癥等疾病[10]；而且它一旦進(jìn)入人體，腸毒素會(huì)引起急性胃腸炎，這已成為世界性的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[11-13]，血漿凝固酶會(huì)造成局部化感染[14]，溶血毒素會(huì)引起局部缺血甚至壞死[15]。乳品中的微生物含量是衡量其品質(zhì)好壞及貨架期的關(guān)鍵因素。超高壓處理（ultrahigh pressure processing，UHP）作為物理作用的非熱殺菌技術(shù)[16]，能夠殺滅微生物，保留食品的天然色澤、香氣成分與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等[17]，同時(shí)還能夠增強(qiáng)乳蛋白的可消化性[18]。超高壓技術(shù)結(jié)合冷凍干燥生產(chǎn)牛初乳，可克服傳統(tǒng)加工方式的缺陷，改善牛初乳制品的生物安全性，提高其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以滅菌壓力、保壓時(shí)間和溫度為因素，研究超高壓處理對(duì)牛初乳中微生物的影響，初步確定牛初乳超高壓滅菌的工藝條件，為超高壓技術(shù)在牛初乳中的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳 由德興隆有限公司提供；蛋白胨、酵母膏等生化試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉、葡萄糖等生化試劑 天津市元立化工有限公司；NaOH、NaCl等試劑 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；微生物測(cè)試紙 廣州綠洲生化科技有限公司。

HPP.L3-600/0.6型超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；SW-CJ-1F型博訊超凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；LRH-70型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Astor 20菌落計(jì)數(shù)器 深圳菲特立科技有限公司；VELP漩渦振蕩器 德祥科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；塑料薄膜封口機(jī) 浙江江南實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 牛初乳的超高壓處理

量取5mL左右的生鮮牛初乳裝于聚乙烯塑料袋內(nèi)，真空密封后進(jìn)行超高壓處理，檢測(cè)處理前后的菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌數(shù)量。

1.2.1 壓力對(duì)牛初乳中微生物的影響 溫度維持在30℃，保壓時(shí)間20min，壓力分別選取100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600MPa處理牛初乳，以未經(jīng)高壓處理的樣品作為空白對(duì)照組，檢測(cè)樣品中菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌數(shù)量。

1.2.2 保壓時(shí)間對(duì)牛初乳中微生物的影響 在壓力350MPa，溫度為30℃，不同時(shí)間（10、20、30、40、50、60min）下處理牛初乳，空白對(duì)照組為未經(jīng)高壓處理的樣品，檢測(cè)處理前后樣品的菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌的數(shù)量。

1.2.3 溫度對(duì)牛初乳中微生物的影響 在壓力為350MPa，保壓時(shí)間20min，溫度分別選取10、15、20、25、30、35、40℃處理牛初乳，未經(jīng)高壓處理的樣品為空白對(duì)照組，測(cè)定樣品中的菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌數(shù)量。

1.2.4 超高壓殺菌條件優(yōu)化 選用處理壓力、作用溫度和保壓時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，同時(shí)將未經(jīng)高壓處理的牛初乳作為空白對(duì)照組，篩選微生物致死率較高的壓力、溫度和時(shí)間組合。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 L9（34）因素水平表Table 1Factor-level design L9（34）

1.3 微生物的檢測(cè)

菌落總數(shù)的測(cè)定根據(jù)國(guó)家食品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2010進(jìn)行，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)采用測(cè)試紙片法，將處理好的樣品吸取1mL接種于測(cè)試紙片上，將上層膜緩慢蓋下，待培養(yǎng)基凝固后，再將測(cè)試紙片疊放在一起放回原自封袋中并封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為（36±1）℃，培養(yǎng)15～24h。每個(gè)樣品檢測(cè)三次，取其平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.4 致死率的計(jì)算

致死率（%）=（對(duì)照組的平均菌數(shù)-處理后樣品的平均菌數(shù)）/對(duì)照組的平均菌數(shù)×100

式中：對(duì)照組的平均菌數(shù)—在常壓下所測(cè)得的菌落總數(shù)平均值或金黃色葡萄球菌的平均值，此時(shí)的致死率為0；處理后樣品的平均菌數(shù)—牛初乳經(jīng)超高壓處理后所測(cè)得的菌落總數(shù)平均值或金黃色葡萄球菌的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和圖表制作利用軟件Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 壓力對(duì)牛初乳中微生物的影響

在溫度為30℃、保壓時(shí)間為20min的條件下，采用不同的壓力處理牛初乳，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著牛初乳所受壓力的增加，滅菌效果也越來(lái)越好，說(shuō)明超高壓對(duì)金黃色葡萄球菌與菌落總數(shù)的作用效果一致。菌落總數(shù)的致死率曲線(xiàn)顯示，當(dāng)壓力從常壓增加至300MPa時(shí)，滅菌效果非常明顯，菌落總數(shù)由原來(lái)的1.3×107減至1.8×106，下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，菌落總數(shù)的致死率呈上升趨勢(shì)，壓力對(duì)菌落總數(shù)的影響基本遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型；當(dāng)壓力增加至400MPa時(shí)，滅菌曲線(xiàn)的上升趨勢(shì)逐漸趨于平緩；當(dāng)壓力超過(guò)400MPa時(shí)，牛初乳中的菌落總數(shù)致死率達(dá)到95.6%，細(xì)菌總數(shù)下降到5.7×105；壓力增至550MPa時(shí)，未檢測(cè)到微生物，致死率達(dá)到100%。

由金黃色葡萄球菌的致死率曲線(xiàn)可得，當(dāng)樣品所受壓力不超過(guò)300MPa時(shí)，隨著所施壓力的升高，金黃色葡萄球菌的數(shù)量由原來(lái)的5.0×104減至1.2×102，金黃色葡萄球菌的致死率呈直線(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)壓力達(dá)到或超過(guò)400MPa時(shí)，致死率達(dá)到了100%。

超高壓滅菌的原理在于高壓使得微生物的細(xì)胞形態(tài)、遺傳機(jī)制以及組織結(jié)構(gòu)等都發(fā)生了改變[19]，對(duì)微生物的破壞作用主要集中于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁[20-21]。研究表明，壓力會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變[22-23]，繼而生物大分子的立體構(gòu)象發(fā)生崩潰，高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)凝固，酶的活性受到抑制，DNA等遺傳物質(zhì)無(wú)法完成復(fù)制[24]，導(dǎo)致了微生物的死亡[25-26]。施加壓力越大，微生物細(xì)胞膜破壞的程度也就越嚴(yán)重，這與本實(shí)驗(yàn)中隨著處理壓強(qiáng)的增大，致死率逐漸上升的趨勢(shì)是一致的。另外，Malicki.A等[27]的研究認(rèn)為，在100～400MPa內(nèi)，壓力的增大能顯著降低沙門(mén)氏菌的存活率，王蕊等[28]將生鮮牛奶置于14℃和430MPa的條件下施壓15min，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌總數(shù)的致死率達(dá)到99.5%，這些都說(shuō)明了隨著施加壓強(qiáng)的增大，滅菌的效果越好。

綜上，選擇450、500和550MPa進(jìn)行下一步的正交實(shí)驗(yàn)。

2.2 保壓時(shí)間對(duì)牛初乳中微生物的影響

在壓力為350MPa、溫度為30℃的條件下，采用不同的保壓時(shí)間處理牛初乳，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論是菌落總數(shù)還是金黃色葡萄球菌，兩者的致死率都逐漸上升。從菌落總數(shù)的致死率曲線(xiàn)圖可以看出，當(dāng)保壓時(shí)間增至20min時(shí)，致死率明顯上升，曲線(xiàn)呈線(xiàn)性變化；當(dāng)保壓時(shí)間超過(guò)30min后，菌落總數(shù)的致死率增幅趨于緩和；在50min時(shí)，致死率為98.2%；在60min時(shí)，致死率為100%。

從金黃色葡萄球菌的致死率曲線(xiàn)圖可以看出，當(dāng)保壓時(shí)間在20min內(nèi)時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌致死率的曲線(xiàn)較陡，上升趨勢(shì)顯著；繼續(xù)延長(zhǎng)保壓時(shí)間，致死率雖在上升，但增加幅度變得平緩；當(dāng)達(dá)到60min時(shí)，金黃色葡萄球菌致死率達(dá)到100%。

Gaenzle M G等[29]利用熒光染色技術(shù)對(duì)超高壓破壞大腸桿菌細(xì)胞膜研究發(fā)現(xiàn)，不可逆的膜損傷與保壓時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。在多數(shù)情況下，保壓時(shí)間越長(zhǎng)，超高壓滅菌的效果越好，但是隨著保壓時(shí)間的增加，其對(duì)滅菌效果的貢獻(xiàn)卻越來(lái)越小，即當(dāng)保壓時(shí)間達(dá)到一定值時(shí)，其對(duì)滅菌效果已基本沒(méi)有太大影響。夏元景等[30]也證實(shí)，當(dāng)壓力、pH等因素固定，達(dá)到一定時(shí)間后，延長(zhǎng)保壓時(shí)間，微生物的致死率將趨于平緩。這些都與圖2的曲線(xiàn)變化圖相一致：在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，致死率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而上升；超過(guò)一定范圍后，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，則致死率變化不大。

綜上，選擇15、20和25min進(jìn)行下一步的正交實(shí)驗(yàn)。

2.3 溫度對(duì)牛初乳中微生物的影響

在壓力為350MPa、保壓時(shí)間為20min的條件下，采用不同的溫度處理牛初乳，結(jié)果如圖3所示。

圖3顯示，溫度對(duì)牛初乳中細(xì)菌總數(shù)的致死作用并非呈線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系，而是出現(xiàn)了上下波動(dòng)。當(dāng)溫度小于20℃時(shí)，致死率隨溫度升高而下降；在20℃時(shí)致死率最低，超高壓處理的結(jié)果最差，致死率僅為33.3%；當(dāng)溫度超過(guò)20℃時(shí)，致死率隨溫度升高又呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)溫度升高到35℃時(shí)，細(xì)菌總數(shù)的致死率超過(guò)95%；40℃時(shí)達(dá)到100%的致死率。

對(duì)于金黃色葡萄球菌，致死率曲線(xiàn)的變化趨勢(shì)與細(xì)菌一致，亦是在20℃時(shí)最低。當(dāng)溫度低于20℃時(shí)，隨溫度升高，致死率逐漸下降；當(dāng)溫度大于20℃時(shí)，隨著溫度升高，致死率逐漸上升；到30℃以后趨勢(shì)變緩；在35℃時(shí)達(dá)到100%的致死率。

超高壓處理乳制品應(yīng)該在適當(dāng)溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。在低溫條件下，超高壓處理易導(dǎo)致細(xì)胞因冰晶析出而加劇破裂，蛋白質(zhì)會(huì)對(duì)高壓更加敏感而容易發(fā)生變性，微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也受到損傷，這些都導(dǎo)致了微生物耐壓性降低，而且在一定范圍內(nèi)溫度越低，對(duì)微生物的損傷也越嚴(yán)重[31-32]；這就是圖3中溫度越低、致死率越高的原因。在較高溫度范圍內(nèi)，溫度與超高壓的處理效果有協(xié)同作用[33]，適當(dāng)?shù)奶岣邷囟?，可降低處理壓?qiáng)，亦可達(dá)到同樣的滅菌效果。升溫改變了微生物細(xì)胞膜的流動(dòng)性，減弱了那些連接生物大分子非共價(jià)鍵之間的作用力，從而加速了高壓處理微生物的滅菌效果，使得致死率隨著溫度的升高而增大[34]。超高壓的滅菌效果優(yōu)于熱處理的滅菌效果，且在保留乳品原有特性方面優(yōu)于熱處理[35]。

綜上，選擇30、35和40℃進(jìn)行下一步的正交實(shí)驗(yàn)。

2.4 超高壓處理牛初乳對(duì)微生物致死條件的優(yōu)化

由表2中菌落總數(shù)的相關(guān)數(shù)據(jù)，分析k值可知，最優(yōu)組合為A3B3C3，即為550MPa、40℃、25min；由極差分析結(jié)果可知：RA＞RB＞RC，因此上述三個(gè)影響因素對(duì)微生物滅菌效果的作用大小順序?yàn)椋簤簭?qiáng)大?。臼簻囟龋颈簳r(shí)間；對(duì)金黃色葡萄球菌的相關(guān)數(shù)據(jù)值可知，A、B、C各自三個(gè)水平中只有第一個(gè)水平數(shù)比較低，另外兩個(gè)水平的作用效果是一致的，即A1＜A2=A3，B1＜B2=B3，C1＜C2=C3。而且極差分析的結(jié)果顯示：壓強(qiáng)、溫度、時(shí)間這三個(gè)因素對(duì)于超高壓殺滅金黃色葡萄球菌的作用效果是一致的。

因此，由正交表分析可得，超高壓處理牛初乳最優(yōu)組合為A3B3C3，即為550MPa、25min、40℃，經(jīng)驗(yàn)證在此條件下，菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌的致死率均為100%。但在實(shí)驗(yàn)中，其他致死率達(dá)到了100%的條件亦為優(yōu)化條件：A3B1C3、A3B2C1、A1B3C3、A2B3C1、A3B3C2，即：550MPa、30℃、25min，550MPa、35℃、15min，450MPa、40℃、25min，500MPa、40℃、15min和550MPa、40℃、20min。

3 結(jié)論

單因素壓強(qiáng)組的實(shí)驗(yàn)中，在一定范圍內(nèi)，隨著處理壓力的增大，菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌的致死率曲線(xiàn)均呈上升趨勢(shì)。但當(dāng)壓力超過(guò)一定范圍后繼續(xù)增大，則對(duì)殺菌效果影響不大；施壓溫度對(duì)殺菌效果也有顯著的影響，溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)促進(jìn)超高壓對(duì)菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌的殺滅作用；保壓時(shí)間也影響超高壓處理對(duì)微生物的殺滅效果。延長(zhǎng)保壓時(shí)間，會(huì)提高菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌的致死率，但時(shí)間超過(guò)一定范圍后則對(duì)滅菌效果沒(méi)有明顯的貢獻(xiàn)。

表2 超高壓處理牛初乳對(duì)微生物致死條件的優(yōu)化結(jié)果Table 2 Conditions optimization results of microbial fatality rate in bovine coloctrum processed by UHP

增大壓強(qiáng)、延長(zhǎng)保壓時(shí)間、提高施壓溫度均會(huì)增強(qiáng)超高壓處理對(duì)菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌的致死率。超高壓處理牛初乳的正交優(yōu)化條件為：當(dāng)壓力為450MPa時(shí)，施壓溫度≥40℃，保壓時(shí)間≥25min；當(dāng)壓力為500MPa時(shí)，施壓溫度≥40℃，保壓時(shí)間≥15min；當(dāng)壓力為550MPa時(shí)，施壓溫度≥30℃，保壓時(shí)間≥25min或施壓溫度≥35℃，保壓時(shí)間≥15min。

綜上所得，本研究采用超高壓技術(shù)殺滅牛初乳中的微生物，處理后牛初乳中菌落總數(shù)和金黃色葡萄球菌殘存很少，甚至未檢出，處理效果較好，可以為牛初乳飲品的生產(chǎn)提供參考。

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