王先平，唐小千，周 麗

（中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于海水和海產(chǎn)品中，是海水養(yǎng)殖動物如魚、蝦、貝類等的致病菌［1］，可引起多種海水養(yǎng)殖動物發(fā)病，如點(diǎn)帶石斑魚［2－3］、大菱鲆［4］、金頭鯛［5］、褐牙鲆［6］、南美白對蝦［7］、雜色鮑［8］、刺參［9］等都可被感染。外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）是革蘭氏陰性菌外膜的一個重要組成部分，具有良好的免疫原性，容易誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫防御應(yīng)答反應(yīng)，是一類良好的免疫保護(hù)性抗原［10］，它主要包括較高拷貝數(shù)的主要蛋白及若干種小分子蛋白［11］。熱修飾性蛋白（Heatmodifiable protein，HMP），是主要外膜蛋白的重要組分之一，該蛋白的電泳遷移性會隨著不同溫度處理而發(fā)生變化［12］，由靠近胞漿的C－端部分和暴露于細(xì)菌表面的由多個β片層折疊而成的 N－端部分構(gòu)成［13－14］，當(dāng)受熱變性時，β片層結(jié)構(gòu)更進(jìn)一步地伸展，蛋白分子的不對稱性增加，結(jié)構(gòu)變得松散膨大，從而導(dǎo)致遷移性減慢［15－16］。熱修飾性蛋白為跨膜蛋白，在維持外膜結(jié)構(gòu)上具有重要的作用［17］，同時它在細(xì)菌間的結(jié)合［18］，噬菌體的附著［19］，孔道蛋白活動［20］以及對動物機(jī)體血清的抵抗方面［21］扮演著重要的角色。

近年來，通過對熱修飾性蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能的研究，探究細(xì)菌傳染機(jī)理、菌間結(jié)合的作用原理［18，21－22］，以及對其免疫原性、抗原保守性的研究，分析其作為亞單位疫苗材料的可能性方面已成為研究重點(diǎn)。Schweizer等［18］研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌K－12的熱修飾性蛋白ProteinⅡ在菌間的結(jié)合過程中起抑制作用；Tagawa等［23］通過對睡眠嗜血菌（Haemophilus somnus）的一個主要熱修飾性外膜蛋白28kDa的研究發(fā)現(xiàn)，其在同血清型細(xì)菌間及其它種屬間具有較高的抗原保守性；同類研究中，多殺巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）的熱修飾蛋白單抗MAb MT4.1可以與近100株不同血清型的多殺巴斯德氏菌菌株及其它巴斯德氏菌屬的細(xì)菌發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，證明了該熱修飾性蛋白具有較高的抗 原 保 守 性［24］。Lutwyche 等［25］以 殺 鮭 氣 單 胞 菌（Aeromonas salmonicida）的熱修飾性外膜蛋白28 kDa免疫虹鱒后，針對病原菌的人工感染顯著降低了虹鱒的死亡率，對魚體起到了良好的保護(hù)效果，證實(shí)了殺鮭氣單胞菌28kDa熱修飾性外膜蛋白具有較好的免疫原性，是一種良好的保護(hù)性抗原。

盡管熱修飾性蛋白在許多革蘭氏陰性菌中得到鑒定，并對其免疫保護(hù)效果開展了研究，但在海洋弧菌中的研究卻鮮見報(bào)道。本研究應(yīng)用十二烷基肌氨酸鈉（Sarkosyl）抽提并結(jié)合超速離心的方法提取了溶藻弧菌SR1的主要外膜蛋白，通過對樣品熱處理結(jié)合電泳及免疫學(xué)手段，篩選、鑒定溶藻弧菌外膜蛋白中的熱修飾性蛋白，并比較分析其抗原保守性，為深入了解海洋弧菌熱修飾性外膜蛋白特性及弧菌亞單位疫苗開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用9株弧菌菌株：溶藻弧菌（V.alginolyticus）SR1、RB、RH2、283、284、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）458、哈維氏弧菌（V.harveyi）295、鰻弧菌（V.anguillarum）72、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）310。SPF大鼠購于青島藥檢所。

各凍存菌株劃線接種于2216E固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落，鰻弧菌接種于營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，其余弧菌皆接種于2216E液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)（200r／min）8h后分別續(xù)接于10倍體積的上述液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)（200r／min）24h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外膜蛋白提取 外膜蛋白的提取采用改進(jìn)的Sarkosyl法進(jìn)行，具體程序參照文獻(xiàn)［25］進(jìn)行。

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE） 采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)SDS－PAGE垂直板凝膠電泳，濃縮膠濃度為4.8%，分離膠濃度為13%，具體方法參照Lutwyche［25］進(jìn)行，略有改動。蛋白樣品溶解于等體積的電泳上樣緩沖液 （0.1mol／L Tris－HC1，4%SDS，12%疏基乙醇，20%甘油，5μg／mL 溴酚藍(lán)），煮沸5min，冷卻后加樣，30mA恒流跑至分離膠后，調(diào)至60mA恒流跑至結(jié)束，取出凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R－250（Sigma）染色后用全自動凝膠成像系統(tǒng)掃描，Gel－Pro Analyzer軟件分析各樣品的蛋白分子量。

1.2.3 菌株SR1熱修飾性蛋白的篩選 根據(jù)熱修飾性蛋白經(jīng)60℃或更低溫度處理時呈現(xiàn)較低的分子量，而經(jīng)更高溫度處理時分子量增加的特性對菌株SR1的熱修飾性蛋白進(jìn)行篩選，具體方法參照文獻(xiàn)［23－24］進(jìn)行。菌株SR1外膜蛋白樣品與等體積電泳上樣緩沖液混勻后，分別于28、37、50、60、70、100 ℃溫度條件下處理5min后上樣，行SDS－PAGE，所得凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色拍照后，以Gel－Pro Analyzer軟件分析比較各梯度溫度處理樣品中蛋白條帶分子量的變化情況。

1.2.4 熱修飾性蛋白的分離純化 外膜蛋白與等體積電泳上樣緩沖液混合后，28℃處理5min后上樣，4℃條件下行SDS－PAGE，80mA恒流跑至結(jié)束，取出凝膠放入鋅－咪唑染液（75mmol／L ZnSO4，75mmol／L Imidazole，200mmol／L NaCl）中，振蕩染色，直至在黑背景光照條件下觀察到蛋白帶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker找到并切下30kDa蛋白條帶。將切取的蛋白條帶放入飽和EDTA溶液中振蕩脫色，待蛋白條帶顏色消失后，再以20%乙醇沖洗3次。把切取的凝膠切碎后，以電洗脫儀電泳洗脫回收目的蛋白（Model 422，Bio－Rad），洗脫樣品以雙蒸水透析過夜，冷凍干燥后以0.01mol／L PBS重懸，用Bradford法檢測樣品的蛋白濃度并將其調(diào)整至1mg／mL，－20℃凍存?zhèn)溆?。取適量純化樣品調(diào)整蛋白濃度至0.1mg／mL，混合等體積電泳上樣緩沖液后分別于28和100℃溫度條件下處理5min后行SDS－PAGE，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R－250染色拍照。

1.2.5 鼠抗溶藻弧菌SR1的30kDa外膜蛋白血清制備

將上述電泳洗脫純化的30kDa外膜蛋白分4次免疫SPF級大鼠，具體程序如下：基礎(chǔ)免疫以蛋白懸液與弗氏完全佐劑2∶1混勻，背部皮下4點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射0.2mL；2周后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫，蛋白懸液與弗氏不完全佐劑2∶1混勻，方法同基礎(chǔ)免疫；接下來2周，每周再加強(qiáng)免疫1次，尾靜脈注射蛋白懸液0.2mL，無佐劑；最后一次加強(qiáng)免疫后第7天心臟一次性采血，室溫傾斜放置2h，放置4℃過夜；次日5 000×g離心20min得抗血清。以間接ELISA方法測得鼠抗溶藻弧菌SR1的30kDa外膜蛋白血清效價為3 200。

1.2.6 免疫印跡分析（Western blotting） 外膜蛋白樣品 經(jīng) SDS－PAGE 后，用 Mini－Protean H cell系 統(tǒng)（Bio－Rad）電轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45μm的NC膜上（30V，5h），NC膜以含4%脫脂奶粉的PBS緩沖液4℃封閉過夜，PBST（含有0.05%Tween－20的PBS緩沖液）洗滌3次，每次5min，然后將NC膜置于PBS稀釋500倍的鼠抗SR1菌株30kDa外膜蛋白血清中37℃溫育1h，PBST洗3次，每次5min，取出后置于PBS稀釋5 000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Sigma）中37℃溫育45min，PBST洗3次，每次5min。最后將膜浸于含有66μL NBT貯液（0.5g NBT溶于10mL 70%二甲基亞砜）、33μL BCIP貯液（0.5g BCIP溶于10mL100%二甲基亞砜）的10mL NBT／BCIP緩沖液中發(fā)色，待有條帶發(fā)出顏色，快速拿出置于超純水中洗滌以終止發(fā)色，晾干后觀察。

1.2.7 間接ELISA法檢測30kDa外膜蛋白的抗原保守性 9株不同弧菌菌株外膜蛋白樣品經(jīng)包被緩沖液 （35mmol／L NaHCO3，5mmol／L Na2CO3，pH ＝9.6）稀釋后（蛋白濃度20μg／mL），取酶標(biāo)板每孔包被100μL，設(shè)4個重復(fù)，4℃包被過夜，以PBST洗滌3次，每次5min，每孔加入200μL含4%BSA的PBS溶液，37℃封閉1h，PBST洗滌3次；每孔加入100μL PBS稀釋1 000倍的鼠抗SR1菌株的30kDa外膜蛋白血清，37℃孵育1h，以PBST同上洗3次；加入100μL PBS稀釋5 000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃溫育45min，PBST洗3次；每孔加入pNPP發(fā)色液（1mg／mL pNPP，35mmol／L NaHCO3，5mmol／L Na2CO3，0.5mmol／L MgC12·6H2O，pH＝9.8）100μL發(fā)色30min，2mol／L NaOH 終止發(fā)色，用酶標(biāo)儀在405nm波長處測量OD值，以PBS代替抗血清作為陰性對照。OD值P／N＞2.1為陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌株SR1熱修飾性蛋白的篩選

菌株SR1外膜蛋白樣品分別經(jīng)28、37、50、60、70和100℃溫度處理后行SDS－PAGE，所得凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色拍照，同時，平行電泳樣品轉(zhuǎn)膜后以抗菌株SR130kDa外膜蛋白血清行Western blotting。

SDS－PAGE圖譜顯示：菌株SR1外膜蛋白經(jīng)28、37和50℃溫度處理，30kDa蛋白豐度無顯著變化，為外膜蛋白樣品的主要高豐度蛋白，但經(jīng)60、70和100℃處理后，該蛋白豐度顯著降低，并伴有4條新的蛋白條帶出現(xiàn)，分子量分別為45、36、34和22kDa（見圖1a）；Western blotting結(jié)果顯示，制備的鼠抗血清可與各梯度溫度處理樣品中的30kDa外膜蛋白發(fā)生不同程度的免疫印跡反應(yīng)，還可與50℃處理樣品中的37.5kDa蛋白及60、70和100℃處理樣品中的36和37.5kDa蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)（見圖1b）。

圖1 不同溫度處理的SR1外膜蛋白SDS－PAGE及其Western blotting圖譜Fig.1 SDS－PAGE of SR1OMPs solubilized at different temperatures and its Western blot reacted with mouse antiserum raised against the 30kDa protein

2.2 菌株SR1 30kDa熱修飾性蛋白的分離純化及熱修飾性分析

全菌外膜蛋白于28℃處理后經(jīng)電泳、切膠、電洗脫獲得30kDa純化蛋白樣品，經(jīng)28℃處理行SDSPAGE，發(fā)現(xiàn)只有極少量蛋白呈現(xiàn)為30kDa，大部分呈現(xiàn)為36和37.5kDa，而經(jīng)100℃處理呈現(xiàn)相同的電泳遷移率變化（見圖2）。

2.3 菌株SR1 30kDa外膜蛋白的抗原保守性分析

2.3.1 免疫印跡分析（Western blotting） 9株弧菌的外膜蛋白一組經(jīng)28℃溫度處理5min，另一組經(jīng)100℃溫度處理5min，分別行SDS－PAGE，所得凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色拍照，同時，平行電泳樣品轉(zhuǎn)膜后以抗菌株SR1的30kDa外膜蛋白血清行Western blotting。

28℃溫度處理樣品SDS－PAGE結(jié)果顯示，溶藻弧菌SR1、283、284、RB、RH2在30kDa處，副溶血弧菌458在29.5kDa處，哈維氏弧菌295在30.5kDa處均有一條較高豐度的外膜蛋白，鰻弧菌72和創(chuàng)傷弧菌310在此分子量附近均無高豐度蛋白（見圖3a）。Western blotting結(jié)果顯示，鼠抗血清能與溶藻弧菌各菌株的30kDa外膜蛋白、副溶血弧菌458的29.5kDa外膜蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，而未與哈維氏弧菌295、鰻弧菌72和創(chuàng)傷弧菌310的外膜蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)（見圖3b）。

100℃溫度處理樣品SDS－PAGE結(jié)果顯示，溶藻弧菌各菌株的30kDa外膜蛋白、副溶血弧菌458的29.5kDa外膜蛋白以及哈維氏弧菌295的30.5kDa外膜蛋白豐度顯著降低（如箭頭所示），同時在分子量33～46kDa范圍內(nèi)出現(xiàn)了5～6條高豐度蛋白條帶（見圖3c）。Western blotting結(jié)果顯示，鼠抗血清能與溶藻弧菌各菌株的36和30kDa蛋白、副溶血弧菌458的35和29.5kDa蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，而未與哈維氏弧菌295及鰻弧菌72、創(chuàng)傷弧菌310的外膜蛋白發(fā)生任何免疫印跡反應(yīng)（見圖3d）。

圖2 經(jīng)不同溫度處理的純化30kDa熱修飾性蛋白與SR1全菌外膜蛋白SDS－PAGE圖譜Fig.2 SDS－PAGE of 30kDa HMP and SR1OMPs solubilized at different temperatures

2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） 間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，鼠抗血清與溶藻弧菌SR1、283、284、RB、RH2及副溶血弧菌458的外膜蛋白反應(yīng)均為陽性，P／N值分別為6.8、4.9、3.4、4.1、6.5、2.3，與其他3種弧菌的外膜蛋白反應(yīng)均為陰性（P／N＜2.1）。

3 討論

熱修飾性蛋白是細(xì)菌主要外膜蛋白的重要組成部分，具有良好的免疫原性，容易誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫防御應(yīng)答反應(yīng)，是一類良好的免疫保護(hù)性抗原［25］。通過篩選致病菌的熱修飾性蛋白，分析其免疫原性及抗原保守性，已成為細(xì)菌病疫苗候選材料篩選的一條新的研究途徑，而對熱修飾性蛋白的篩選是研究的第一步。從細(xì)菌外膜蛋白中篩選鑒定熱修飾性蛋白普遍采用的方法是將蛋白樣品溶解于電泳上樣緩沖液中，經(jīng)不同溫度處理后行SDS－PAGE，此蛋白的分子量會隨處理溫度的不同而發(fā)生改變，當(dāng)在60℃或更低溫度下處理時，熱修飾性蛋白會呈現(xiàn)較低的分子量，而在100℃處理時分子量會增加［23－24］。Marandi等［24］對多殺巴斯德氏菌外膜蛋白的熱修飾性研究中發(fā)現(xiàn)一個經(jīng)60℃處理時分子量為28kDa的主要外膜蛋白在經(jīng)100℃加熱處理后分子量增加為37kDa，表現(xiàn)出明顯的熱修飾特征；Magalashvili等［26］分離純化了不解糖卟啉單胞菌（Porphyromonas asaccharolytica）的 37kDa Omp－PA，對其于95℃條件下加熱處理后發(fā)現(xiàn)，該蛋白的大部分蛋白組分遷移至41kDa分子量處，僅有一小部分殘留于37kDa處。本實(shí)驗(yàn)在對溶藻弧菌SR1外膜蛋白經(jīng)不同溫度處理后的SDS－PAGE分析中發(fā)現(xiàn)一條30kDa的高豐度外膜蛋白經(jīng)28、37和50℃處理蛋白豐度無顯著變化，而經(jīng)60、70和100℃處理后蛋白豐度顯著降低，同時伴有36kDa蛋白的出現(xiàn)及37.5kDa蛋白豐度的顯著增加，結(jié)合 Western blotting結(jié)果證實(shí)30kDa蛋白與36、37.5kDa蛋白具有交叉免疫反應(yīng)，推測30kDa蛋白與36、37.5kDa蛋白具有較高的同源性，僅以不同的熱修飾性形式存在，說明30kDa蛋白組分具有熱修飾性，是一種熱修飾性蛋白。

圖3 9株弧菌主要外膜蛋白經(jīng)28℃、100℃處理后的SDS－PAGE及其Western－blotting圖譜Fig.3 SDS－PAGE of OMPs of 9strains of Vibrio solubilized at 28 ℃and 100 ℃ respectively and their Western blot reacted with mouse antiserum raised against the 30kDa protein

分離純化已篩選出的熱修飾性蛋白為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)，排除無關(guān)蛋白的干擾提供了方便。本實(shí)驗(yàn)將切膠純化后的30kDa蛋白分別經(jīng)28℃、100℃溫度處理后行SDS－PAGE發(fā)現(xiàn)，經(jīng)28℃處理，原本分子量為30kDa的外膜蛋白大部分卻呈現(xiàn)為36、37.5kDa，只有極少部分呈現(xiàn)為30kDa。Sugawara等［20］研究發(fā)現(xiàn)在熱修飾性蛋白的純化過程中，因熱修飾性蛋白極易變性，在透析液中透析脫鹽時，部分蛋白分子慢慢轉(zhuǎn)變成變性的蛋白形式，結(jié)構(gòu)由原來的堅(jiān)實(shí)變得松散，從而導(dǎo)致電泳遷移率減小，呈現(xiàn)出與經(jīng)加熱處理后表現(xiàn)出的相同電泳遷移率變化，其結(jié)構(gòu)變化的機(jī)理還不清楚。結(jié)合30kDa外膜蛋白的熱修飾性可推測：30kDa蛋白內(nèi)存在3個蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過加熱處理后，其中2個蛋白質(zhì)點(diǎn)因?qū)彷^敏感而發(fā)生熱修飾性作用，在電泳中遷移性減慢，分別遷移至36、37.5kDa分子量處；另外一個蛋白點(diǎn)對熱不敏感，100℃時依然保持于30kDa的分子量處。

已經(jīng)有越來越多的研究證實(shí)熱修飾性蛋白在種間的抗原保守性較高，且其具有較強(qiáng)的免疫原性，是一種重要的保護(hù)性抗原。Lutwyche等［25］使用殺鮭氣單胞菌的分子量為28kDa熱修飾性外膜蛋白免疫虹鱒的接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)了此熱修飾性外膜蛋白具有較好的免疫原性，可對虹鱒提供較好的免疫效果，是一種良好的保護(hù)性抗原。Tagawa等［23］使用可特異性識別睡眠嗜血桿菌的熱修飾性外膜蛋白的小鼠單抗MAb 27－1，與45株不同血清型的睡眠嗜血桿菌及大腸桿菌K－12的全菌進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)不同血清型的睡眠嗜血桿菌中的熱修飾性蛋白及大腸桿菌的OmpA蛋白均可與之發(fā)生陽性的免疫印跡反應(yīng)，此結(jié)果證實(shí)了睡眠嗜血桿菌的熱修飾性外膜蛋白具有較高的抗原保守性。本實(shí)驗(yàn)通過Western blotting、間接ELISA法分析溶藻弧菌SR1熱修飾性蛋白30kDa與其他弧菌外膜蛋白間的交叉反應(yīng)性，結(jié)果表明5株溶藻弧菌的30kDa外膜蛋白及副溶血弧菌458的29.5kDa外膜蛋白間具有共同抗原表位，可發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，而與其他3種弧菌外膜蛋白的抗原同源性較低。溶藻弧菌SR1的30kDa外膜蛋白在溶藻弧菌種內(nèi)的抗原保守性較高，而在弧菌屬不同種間抗原保守性較低，此結(jié)果對于研制溶藻弧菌外膜蛋白亞單位疫苗有一定的參考意義。

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