薛育政 吳燕敏 吳鐵龍 盛穎玥 余利華 曹海燕 楊睛 林剛 陸宇峰 劉宗良 俞憲民 李兆申

5-HT及5-HT2A受體在大鼠急性壞死性胰腺炎腸功能障礙時的表達及機制研究

薛育政 吳燕敏 吳鐵龍 盛穎玥 余利華 曹海燕 楊睛 林剛 陸宇峰 劉宗良 俞憲民 李兆申

人體中約90% 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)存在于胃腸道，其余存在于血小板及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。最近研究表明，攝入的食物到達十二指腸時不僅能刺激膽囊收縮素(CCK)的釋放，同時刺激腸嗜鉻細胞釋放5-HT。5-HT的釋放又反射性激活迷走神經(jīng)傳入纖維上的相應(yīng)受體，進而激活腸反射通路，引起腸蠕動增快[1-2]。近年來，5-HT2A受體(5-HT2AR)和5-HT2B受體(5-HT2BR)對胃腸運動的影響越來越受到人們關(guān)注。Bertoni等[3]用5-HT2A激活劑成功制造了腸系膜缺血-再灌注損傷小鼠模型，并證實了腸系膜缺血-再灌注損傷可以造成胃腸運動的減弱。

胃腸功能障礙是重癥急性胰腺炎(SAP)常見的并發(fā)癥。目前對5-HT及其受體在SAP胃腸功能障礙中的變化及作用機制鮮有報道。本研究檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠血5-HT含量及腸黏膜中5-HT2AR的表達，探討5-HT及5-HT2AR在ANP腸功能障礙中的作用及可能機制。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：SPF級雄性SD大鼠36只，體重(200±20)g，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(蘇，2002-0022)。按完全隨機法將大鼠分為ANP組和假手術(shù)組，每組18只。根據(jù)文獻[4]，采用膽胰管內(nèi)注入3.5%?；悄懰徕c0.1 ml/100 g體重(Sigma公司)的方法制備ANP模型。假手術(shù)組大鼠開腹后僅翻動十二指腸并觸摸胰腺數(shù)次后關(guān)腹。術(shù)后3、6、12 h分批處死6只大鼠。

2．血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量測定：取血分離血清。全自動生化分析儀檢測血淀粉酶、脂肪酶水平， ELISA法測定血5-HT、IL-6含量。

3．小腸推進率測定：制模后2.5 h用含苯酚紅2 mg/ml的生理鹽水1.0 ml給大鼠灌胃，30 min后快速剖腹取出小腸。剪下幽門遠端至闌尾近端的腸管，鋪在紙上，不加任何拖曳牽引，測小腸全長和苯酚紅前沿至幽門遠端的距離。若苯酚紅前沿顯示不清楚，可在疑似處剪開小腸，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液確認(顯示鮮亮的玫紅色)，并需在其前和后各1 cm處再次滴加NaOH溶液驗證，以保證數(shù)據(jù)的準確性。小腸推進率為苯酚紅推進的小腸長度/小腸全長×100%。

4．腸黏膜5-HT2AR蛋白表達檢測：取6 h點大鼠距屈氏韌帶10 cm的空腸、末端回腸及乙狀結(jié)腸組織(約50 mg)，常規(guī)提取總蛋白后行蛋白質(zhì)印跡法檢測5-HT2AR蛋白，以β-actin作為內(nèi)參。兔抗大鼠5-HT2AR多克隆抗體工作濃度1∶400，羊抗兔Ig-HRP工作濃度1∶500，最后，ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。

5．腸黏膜5-HT2A蛋白表達檢測：取3、6、12 h點大鼠距屈氏韌帶10 cm的空腸、末端回腸及乙狀結(jié)腸組織約5 mm×5 mm大小，常規(guī)固定、石蠟包埋、切片，行免疫組化法檢測5-HT2A蛋白表達。抗5-HT2A一抗工作濃度1∶300，辣根過氧化物酶標記的二抗工作濃度1∶500，最后DAB顯色，復(fù)染、脫水、封片。胞質(zhì)呈棕色染色為陽性細胞。每張切片選擇5個高倍鏡視野，應(yīng)用Leica RX250型圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描，Qwin軟件分析，自動計算5-HT2A陽性細胞面積，取均值。

6．胰腺組織病理學(xué)檢查：胰腺組織經(jīng)HE染色后由兩位專業(yè)的病理醫(yī)師雙盲閱片。每組隨機取3張切片，每張切片隨機選取10個高倍視野，從水腫、感染、出血和壞死4個方面評價胰腺組織損傷的程度。

二、結(jié)果

1．大鼠血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量變化：ANP組大鼠血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量均較同時間點假手術(shù)組大鼠顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。

表1 兩組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量變化

注：與假手術(shù)同時點組比較，aP<0.05

2．大鼠胰腺組織病理學(xué)改變：假手術(shù)組大鼠胰腺表現(xiàn)為部分間質(zhì)水腫，少量炎性細胞浸潤，偶可見點狀出血，極少量腺泡細胞壞死。ANP組大鼠3 h時可有明顯的小葉間水腫，散在片狀出血，較多炎性細胞浸潤，部分腺泡細胞變性壞死；6、12 h可見大量炎性細胞浸潤，多處片狀出血，小葉結(jié)構(gòu)破壞，大量腺泡細胞壞死(圖1)。

圖13、6、12 h點(a、b、c)假手術(shù)組(上)及ANP組(下)胰腺病理變化(HE ×400)

3．大鼠小腸推進率：ANP組大鼠3 h時的小腸推進率為(24.78±4.25)%，假手術(shù)組大鼠為(61.54±9.01)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

4．大鼠腸黏膜中5-HT2AR蛋白的表達：ANP組大鼠6 h時空腸、末端回腸及乙狀結(jié)腸黏膜5-HT2AR蛋白表達水平均較假手術(shù)組顯著增強(圖2)。

圖2假手術(shù)組6 h點大鼠空腸(a)、末端回腸(b)、乙狀結(jié)腸(c)及ANP組6 h點大鼠空腸(d)、末端回腸(e)、乙狀結(jié)腸(f)黏膜中5-HT2AR蛋白的表達

5．大鼠腸黏膜中5-HT2A蛋白表達：ANP組大鼠3、6、12 h空腸5-HT2A陽性細胞面積分別為(4.85±0.53)、(5.04±0.61)、(4.79±0.56)萬μm2，較假手術(shù)組大鼠的(3.46±0.35)、(3.78±0.47)、(3.86±0.43)萬μm2均顯著增多；ANP組末端回腸5-HT2A陽性細胞面積分別為(4.91±0.61)、(4.79±0.53)、(5.16±0.73)萬μm2，較假手術(shù)組的(3.67±0.45)、(3.78±0.48)、(3.53±0.38)萬μm2均顯著增多；ANP組乙狀結(jié)腸5-HT2A陽性細胞面積分別為(4.79±0.69)、(4.83±0.74)、(4.94±0.82)萬μm2，較假手術(shù)組的(3.65±0.44) 、(3.79±0.51)、(3.87±0.59)萬μm2均顯著增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，圖3、4、5)。

圖33、6、12 h點(a、b、c)假手術(shù)組(上)及ANP組(下)空腸黏膜中5-HT2A陽性細胞(免疫組化 ×400)

圖43、6、12 h點(a、b、c)假手術(shù)組(上)及ANP組(下)回腸黏膜中5-HT2A陽性細胞(免疫組化 ×400)

圖53、6、12 h點(a、b、c)假手術(shù)組(上)及ANP組(下)乙狀結(jié)腸黏膜中5-HT2A陽性細胞(免疫組化 ×400)

討論腸功能障礙是SAP最常見的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為腸動力減弱、腸黏膜缺血再灌注性損傷及繼發(fā)性腸黏膜通透性增加[5]，一旦發(fā)生腸功能障礙，可進一步引起腸源性感染甚至多臟器功能衰竭，最終導(dǎo)致SAP患者病死率增加。臨床發(fā)現(xiàn)，及時有效治療SAP患者繼發(fā)的腸道功能障礙，可有效降低SAP患者并發(fā)癥的發(fā)生率及病死率。

夏敏等[6]研究發(fā)現(xiàn)，血清中IL-6的水平與急性胰腺炎病情嚴重程度及并發(fā)癥的發(fā)生率呈顯著正相關(guān)。Ito等[7]研究證實，5-HT2AR的激活能增加5-HT誘導(dǎo)平滑肌細胞產(chǎn)生IL-6。本研究結(jié)果顯示，ANP組大鼠血清5-HT、IL-6水平較假手術(shù)組明顯升高，且隨時間的延長而增加；空腸、末端回腸及乙狀結(jié)腸黏膜5-HT2AR及5-HT2A蛋白表達均較假手術(shù)組顯著增加，提示腸黏膜組織中5-HT2AR的激活能反射性地引起血清5-HT濃度增加，而血清5-HT的增加可提高血管通透性和促進內(nèi)皮細胞產(chǎn)生嗜中性粒細胞趨化作用[8-9]，導(dǎo)致繼發(fā)性腸黏膜通透性增加及腸黏膜缺血再灌注性損傷，這可能是ANP發(fā)生腸功能障礙的機制之一。

[1] Gershon MD. Nerves, reflexes, and the enteric nervous system: pathogenesis of the irritable bowel syndrome. J Clin Gastroenterol, 2005, 39: S184-S193.

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[4] 薛育政, 劉宗良, 俞憲民,等. 還原型谷胱甘肽對實驗性急性壞死性胰腺炎的治療效果及機制.胰腺病學(xué), 2007, 7: 212-215.

[5] 楊朝暉. 全身炎癥反應(yīng)綜合征與急性胰腺炎病情的相關(guān)分析. 中華消化雜志, 2006, 26: 196-197．

[6] 夏敏，沈美琴，陳衛(wèi)昌.血清促炎細胞因子水平與急性胰腺炎嚴重程度的相關(guān)性研究.中華消化雜志，2011,31:401-404.

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2013-02-04)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.015

江蘇省“333工程”科研項目(CAE01101-06)；江蘇省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥科技項目(LZ11127)；無錫巿社會發(fā)展項目(CSZ00N1110)

214041，無錫，無錫巿第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科(薛育政、吳燕敏、吳鐵龍、盛穎玥、余利華、曹海燕、楊睛、林剛、陸宇峰、劉宗良、俞憲民)；第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科(李兆申)

李兆申，Email：zhaoshenli666@126.com