郝順心 沈新明 吳瑞喬 王益 艾常華 嚴(yán)燕國 吳剛 張晶

·短篇論著·

JAK/STAT通路對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織TNF-α表達(dá)的影響

郝順心 沈新明 吳瑞喬 王益 艾常華 嚴(yán)燕國 吳剛 張晶

炎癥遞質(zhì)在重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，阻斷炎癥遞質(zhì)可降低SAP的嚴(yán)重程度并提高SAP的治療效果。JAK/STAT通路與SAP的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，它直接參與細(xì)胞因子受體-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。TNF-α是一種強(qiáng)有力的促炎細(xì)胞因子，在SAP的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。本研究旨在探討SAP時JAK/STAT通路對胰腺組織TNF-α表達(dá)的影響及意義。

一、材料與方法

1．動物分組和模型制作：SPF級雄性Wistar大鼠54只由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，體重200～250 g。按隨機(jī)表法分為假手術(shù)組、急性壞死性胰腺炎(acute pancreatitis necrotizing, ANP)組、JAK抑制劑AG490處理組(AG490組)，每組18只。采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c(Sigma公司)溶液1 ml/kg體重的方法制備ANP模型。假手術(shù)組膽胰管內(nèi)注入等容積生理鹽水。AG490組在造模前30 min皮下注射AG490(Selleck公司)8 mg/kg體重。術(shù)后3、6、12 h分批剖殺大鼠，心臟采血，分離血清，置-20℃保存；取胰頭部胰腺組織，用4%多聚甲醛固定，其余胰腺組織經(jīng)液氮速凍后置-80℃冰箱保存。

2．血清淀粉酶活性檢測：采用全自動生化分析儀測定。

3．胰腺病理學(xué)檢查：取固定的胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，按Schmidt等[1]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評分。

4．胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)的檢測：取100 mg凍存的胰腺組織，應(yīng)用Trizol抽提總RNA，應(yīng)用第一鏈cDNA合成試劑盒(MBI公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用PCR試劑盒(MBI公司)進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：TNF-α(326 bp)上游為5′-CATGTACCTGGGAGGAGTCT-3′，下游為5′-CTTCAGCAT-CTCGTGTGTTT-3′；內(nèi)參β-actin(207 bp)上游為5′-CCA-ACTGGGACGATATGGAG-3′，下游為5′-CAGAGGCAT-ACAGGGACAAC-3′。引物由美國Invitrogen公司設(shè)計合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、56℃(TNF-α)或54℃ (β-actin)30 s、72℃ 1 min， 35個循環(huán)，72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以TNF-α與β-actin條帶灰度比值表示mRNA的表達(dá)水平。

二、結(jié)果

1．血淀粉酶的變化：假手術(shù)組大鼠血清淀粉酶活性在正常范圍；ANP組大鼠血清淀粉酶活性較假手術(shù)組顯著增高，且隨著時間推移活性逐漸升高； AG490組大鼠血清淀粉酶活性較ANP組顯著下降，但仍顯著高于假手術(shù)組(表1)。

表1 3組大鼠血清淀粉酶活性變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01

2．胰腺組織病理學(xué)改變：假手術(shù)組大鼠胰腺呈淡粉紅色，光澤度好；鏡下見胰腺小葉結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)清晰。ANP組大鼠3 h時胰腺水腫明顯，十二指腸區(qū)囊腫樣變，膽胰管周圍見斑片狀出血，小腸系膜可見白色皂化點，12 h見胰腺重度水腫，呈囊腫樣變，出血壞死范圍明顯擴(kuò)大，后腹膜、腎前筋膜和腸系膜可見明顯的皂化區(qū)，胃極度擴(kuò)張，腹腔大量血性腹水；3 h時鏡下見胰腺腺泡水腫，區(qū)域性壞死、脂肪液化壞死和出血，炎癥細(xì)胞浸潤，12 h見胰腺破壞更加廣泛和嚴(yán)重，腺泡結(jié)構(gòu)大量消失，殘存的胰腺小葉孤立于廣泛的壞死區(qū)，廣泛脂肪液化壞死和出血，大量炎癥細(xì)胞浸潤。AG490組大鼠肉眼觀胰腺病變程度較ANP組減輕，后腹膜、腎前筋膜和腸系膜皂化區(qū)范圍較ANP組縮??；3 h時鏡下見胰腺腺泡水腫，少量壞死區(qū)，炎癥細(xì)胞浸潤，且隨時間延長逐漸加重，但較同時間點ANP組明顯減輕(圖1)。ANP組的胰腺病理評分較假手術(shù)組顯著升高，AG490組較ANP組顯著下降，但仍顯著高于假手術(shù)組(表2)。

圖1假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、AG490組(c)大鼠12 h時胰腺大體(上)及組織病理學(xué)(下)改變(HE ×100)

表2 3組大鼠各時間點胰腺組織病理評分

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.05，cP<0.01

3．胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)的變化：假手術(shù)組大鼠胰腺組織TNF-α mRNA低表達(dá)。ANP組大鼠胰腺組織TNF α mRNA表達(dá)增強(qiáng)，6 h時達(dá)高峰，表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組。AG490組大鼠胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)顯著低于ANP組，但仍顯著高于假手術(shù)組(表3，圖2)。

表3 3組大鼠各時間點TNF-α mRNA表達(dá)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01

圖2 各組大鼠胰腺組織TNF-αmRNA的表達(dá)

討論在眾多炎癥遞質(zhì)中，TNF-α是SAP中最早升高的細(xì)胞因子，作為始發(fā)因子激發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-6、IL-8及TNF-α自身等因子的產(chǎn)生[2-3]，參與多器官功能不全的發(fā)生。TNF-α也是損傷遠(yuǎn)處臟器的重要因子，其水平與SAP的嚴(yán)重程度、病死率和患者預(yù)后呈明顯正相關(guān)。Oruc等[4]用抗TNF-α單抗infliximab預(yù)處理急性胰腺炎大鼠，結(jié)果明顯降低急性水腫型胰腺炎大鼠的血清淀粉酶活性及胰腺病理損傷，抑制中性粒細(xì)胞浸潤及胰腺組織的髓過氧化物酶活性。

JAK-STAT通路是在研究干擾素( IFN-α, IFN-γ) 對培養(yǎng)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用中發(fā)現(xiàn)的一條新的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5]。JAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶(PTK)，既能催化與之相連的細(xì)胞因子受體發(fā)生酪氨酸磷酸化，又能磷酸化多種含特定SH2區(qū)的信號分子從而使其激活。STATs是JAKs磷酸化作用的底物，能將信號直接傳遞到核內(nèi)，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。JAK-STAT通路的信號傳遞過程為細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后引起受體分子的二聚化，使得與受體耦聯(lián)的JAK相互接近并通過相互的酪氨酸磷酸化而活化，活化的JAKs催化受體本身的酪氨酸磷酸化，并形成相應(yīng)的STATs結(jié)合位點，使STATs通過SH2功能區(qū)與受體結(jié)合，并在JAKs的作用下實現(xiàn)其磷酸化而活化，然后STATs形成同或異二聚體并進(jìn)入核內(nèi)，與相應(yīng)的靶基因啟動子結(jié)合而激活相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和血管發(fā)生等正常生理過程中起著重要的作用，亦與某些疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。該通路的異常激活會導(dǎo)致不同的病理過程，而抑制該通路的活化能減輕疾病的病理損傷[6]。Gallmeier等[7]研究發(fā)現(xiàn)胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)存在JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能對干擾素介導(dǎo)的急性胰腺炎作出反應(yīng)。Robinson等[8]證實，TNF-α刺激胰腺腺泡細(xì)胞后，IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α等細(xì)胞因子生成明顯增多，而用PYY減少STAT與反應(yīng)元件的結(jié)合后，上述細(xì)胞因子生成明顯減少。因此，推測JAK-STAT信號通路可能在基因水平上調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)，其在SAP中的作用可能與核因子-κB(NF-κB)相似。AG490是酪氨酸激酶抑制劑，是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，結(jié)構(gòu)類似酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競爭結(jié)合位置，特異性抑制JAK，有效阻斷其下游的STATs活化。 JAK-STAT通路的活化能促進(jìn)ANP大鼠TNF-α的合成，加重胰腺的病理損傷[9]。本研究結(jié)果表明，ANP大鼠胰腺組織TNF-α mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而使用AG490后TNF-α mRNA的表達(dá)明顯降低，說明抑制JAK-STAT通路的活化可以抑制TNF-α的合成，減輕胰腺的病理損傷，對ANP大鼠起到保護(hù)作用，為臨床治療SAP提供一個新的思路及實驗依據(jù)。

[1] Schmidt J，Rattner DW，Lewandrowski K，et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg，1992，215: 44-56.

[2] Norman J, Franz M, Messina J, et al. Interleukin-1 receptor antagonist decreases severity of experimental acute pancreatitis. Surgery, 1995,117:648-655.

[3] 毛恩強(qiáng), 湯耀卿, 張圣道,等. 重癥胰腺炎感染期TNF-α的變化及對器官功能的影響. 中華肝膽外科雜志, 2002,8:97-99.

[4] Oruc N, Ozutemiz AO, Yukselen V, et al. Infliximab: a new therapeutic agent in acute pancreatitis? Pancreas, 2004,28:e1-e8.

[5] Darnell JE Jr，Kerr IM，Stark GR.Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins.Science，1994，264: 1415-1421.

[6] Huang Y，Cen LP，Choy KW，et al.JAK/STAT pathway mediates retinal ganglion cell survival after acute ocular hypertension but not under normal conditions.Exp Eye Res，2007，85: 684-695.

[7] Gallmeier E，Sch?fer C，Moubarak P，et al. JAK and STAT proteins are expressed and activated by IFN-gamma in rat pancreatic acinar cells. J Cell Physiol，2005，203: 209-216.

[8] Robinson K，Vona-Davis L，Riggs D，et al. Peptide YY attenuates STAT1 and STAT3 activation induced by TNF-alpha in acinar cell line AR42J. J Am Coll Surg，2006，202: 788-796.

[9] 郝順心, 王衛(wèi)星, 陳辰,等. 羅格列酮對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織STAT1的影響. 中華外科雜志, 2009,47:218-221.

2012-12-05)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.016

430064 湖北武漢，武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院普外科

郝順心，Email:pjcps@126.com