劉飛 周金蓮 段育忠 張?jiān)娏?楊建武 楊鶴鳴 李成林 崔彥

·論著·

模擬失重大鼠胰腺組織HSP70表達(dá)的變化

劉飛 周金蓮 段育忠 張?jiān)娏?楊建武 楊鶴鳴 李成林 崔彥

目的研究模擬失重環(huán)境下大鼠胰腺組織HSP70表達(dá)的變化。方法健康雄性Wistar大鼠64只，采用尾懸吊法建立模擬失重動(dòng)物模型。按完全隨機(jī)法分為懸尾6、12 h及1、2、3、5、7 d組和未懸尾對(duì)照組。應(yīng)用免疫組化法、蛋白質(zhì)印跡法和RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠胰腺組織HSP70蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果免疫組化染色顯示，對(duì)照組大鼠胰腺組織無(wú)HSP70蛋白表達(dá)，懸尾組大鼠胰腺組織均有HSP70蛋白表達(dá)，尤其是胰島細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核在早期即深染。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，懸尾6、12 h及1、2 d組大鼠胰腺組織HSP70蛋白持續(xù)高表達(dá)，分別為0.921±0.078、0.862±0.048、0.838±0.063、0.807±0.071，較對(duì)照組的0.693±0.055顯著增加(P<0.05)；3、5、7 d組的HSP70蛋白表達(dá)恢復(fù)到對(duì)照組水平。HSP70 mRNA表達(dá)在6 h組即明顯增加至0.881±0.013，然后逐漸回落，3 d組降至0.694±0.027，5 d組出現(xiàn)回升，達(dá)0.836±0.014，7 d組又回落至0.674±0.013。結(jié)論模擬失重使大鼠胰腺組織中HSP70蛋白和mRNA表達(dá)發(fā)生明顯變化，早期過(guò)表達(dá)，后期恢復(fù)正常水平。

失重模擬； 胰腺； HSP70熱休克蛋白質(zhì)類； 大鼠

隨著宇宙探測(cè)活動(dòng)的日益頻繁和空間技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)于失重狀態(tài)下航天員身體各器官系統(tǒng)變化的研究顯得愈加重要。胰腺作為人體最大的消化和內(nèi)分泌器官之一，了解失重對(duì)其功能及結(jié)構(gòu)影響的意義十分重大。然而國(guó)內(nèi)外在這方面的研究報(bào)道相對(duì)較少[1-3]。本研究檢測(cè)模擬失重環(huán)境下大鼠胰腺組織中誘導(dǎo)型熱休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)的表達(dá)，探討胰腺組織對(duì)失重的應(yīng)激反應(yīng)特點(diǎn)，為航天員訓(xùn)練和飛行的醫(yī)療保障提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠64只，平均體重(300±50) g，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所提供。飼養(yǎng)條件為人工控溫(22±2)℃，每12 h晝夜循環(huán)，自由飲水采食。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

采用尾吊法建立模擬失重模型[4]，即將大鼠尾部吊起，頭體下懸，前肢著地，后肢完全解除負(fù)荷，與地面成30°，可以自由活動(dòng)。按數(shù)字表法隨機(jī)分為懸尾6、12 h及1、2、3、5、7 d組，并以未懸尾作為對(duì)照組，每組8只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg體重)麻醉大鼠，無(wú)菌操作，經(jīng)腹正中線剖腹，取胰尾組織保存于-80°冰箱中，胰頭組織浸于4%多聚甲醛(pH7.4)固定，常規(guī)石蠟包埋。

二、大鼠胰腺組織HSP70蛋白檢測(cè)

取各組石蠟包埋的胰腺組織，常規(guī)切片，采用免疫組化法檢測(cè)胰腺組織HSP70蛋白表達(dá)?？笻SP70單抗購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals，Biolab，生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素購(gòu)自美國(guó)Zymed公司，最后 DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。鏡下見(jiàn)胞核和(或)胞質(zhì)中有明顯的棕黃色顆粒為HSP70表達(dá)陽(yáng)性。

另取凍存的新鮮胰腺組織，在液氮預(yù)冷的研缽中研碎，加入組織裂解液(含蛋白酶抑制劑)置冰上20 min，低溫下12 000 r/min離心15 min，取上清。Bradford法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HSP70蛋白表達(dá)，最后ECL發(fā)光，暗室內(nèi)顯影。以 GAPDH作為內(nèi)參。應(yīng)用AlphaImager 2200 軟件分析條帶的吸光值，以HSP70條帶與GAPDH條帶的吸光值比值表示蛋白表達(dá)量。

三、大鼠胰腺組織HSP70 mRNA檢測(cè)

根據(jù)Genebank設(shè)計(jì)引物序列。HSP70上游引物5′-ATCATCTCAACGAGCCACAG-3′，下游引物5′-ACAGGTCCGAGCACAGCT-3′，擴(kuò)增片段415 bp；GAPDH上游引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物5′-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3′，擴(kuò)增片段186 bp。 取凍存胰腺組織放入研磨器中研磨，按100 mg粉末加入1 ml Trizol提取總RNA，采用RT-PCR法檢測(cè)HSP70mRNA的表達(dá)。PCR條件：94℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，以目的條帶與GAPDH條帶的灰度比值表示HSP70 mRNA的表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程順利，無(wú)大鼠死亡。懸吊第1天，大鼠煩躁不安，精神萎靡，排泄物增多，飲食較對(duì)照組減少，2 d以后各組大鼠逐漸恢復(fù)平靜，飲食、飲水逐漸正常。

二、胰腺組織HSP70蛋白表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腺泡細(xì)胞和胰島細(xì)胞均未見(jiàn)著色(圖1a)。懸尾各組大鼠胰腺組織均有HSP70陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為胞質(zhì)和胞核呈棕褐色。在懸吊6 h～2 d期間，腺泡細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)量隨懸吊時(shí)間延長(zhǎng)而增加，表現(xiàn)為胞質(zhì)染色逐漸加深，胰島細(xì)胞在模擬失重早期即過(guò)表達(dá)，表現(xiàn)為胞質(zhì)深染(圖1b～d)；懸吊3～5 d組大鼠胰腺組織的HSP70蛋白表達(dá)逐漸下降，染色逐漸變淺。

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，各組大鼠胰腺組織均有HSP70蛋白表達(dá)(圖2)。懸吊6 h組HSP70蛋白表達(dá)水平最高，并持續(xù)高表達(dá)達(dá)2 d，均較對(duì)照組顯著升高(P值均<0.05)；懸吊3 d后HSP70蛋白表達(dá)下降，3、5、7 d時(shí)的HSP70表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

三、胰腺組織HSP70 mRNA的表達(dá)

各組大鼠胰腺組織中均有HSP70 mRNA表達(dá)(圖3)，表現(xiàn)為早期上升后期回落的特征。模擬失重6 h大鼠胰腺組織HSP70 mRNA表達(dá)水平即升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。12 h及1、2、3 d組的HSP70 mRNA表達(dá)逐漸回落，但5 d組出現(xiàn)回升，7 d組又降至正常水平(表1)。

圖1對(duì)照組(a)及尾懸吊12 h(b)、1d(c)、2 d(d)大鼠胰腺組織的HSP70表達(dá)(免疫組化 ×400)

1：對(duì)照組；2～3：懸尾6、12 h組；4～8：懸尾1、2、3、5、7 d組

組別只數(shù)mRNA表達(dá)量蛋白表達(dá)量對(duì)照組80．675±0．0160．693±0．055懸尾6h組80．881±0．013a0．921±0．078a 12h組80．874±0．014a0．862±0．048a 1d組80．865±0．014a0．838±0．063a 2d組80．837±0．012a0．807±0．071a 3d組80．694±0．0270．691±0．059 5d組80．836±0．014a0．633±0．062 7d組80．674±0．0130．604±0．069

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

1：對(duì)照組；2～3：懸尾6、12 h組；4～8：懸尾1、2、3、5、7 d組

討 論

HSP70是進(jìn)化上高度保守的一種特殊應(yīng)激蛋白質(zhì)，具有分子伴侶作用。正常情況下，HSP70在細(xì)胞質(zhì)較低表達(dá)。多種不良刺激，如熱刺激、缺血、缺氧、過(guò)氧化、低血糖、紫外線、γ射線、外傷、病毒和細(xì)菌感染以及某些化學(xué)物質(zhì)(乙醇、亞砷酸鈉、砒霜)中毒[5-7]等均可誘導(dǎo)細(xì)胞胞核中HSP70蛋白在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)迅速增加，聚集核內(nèi)并包圍核仁。一但刺激消除或?qū)Υ碳みm應(yīng)后，組織細(xì)胞便進(jìn)入應(yīng)激恢復(fù)期，胞核中HSP70表達(dá)減少甚至中止，但胞質(zhì)中仍有低水平表達(dá)。HSP70在應(yīng)激過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚[6-7]。

相關(guān)研究表明，失重狀態(tài)及其一系列連鎖反應(yīng)亦屬于對(duì)機(jī)體的特殊刺激[8-9]。失重作為一種特殊的應(yīng)激原，同樣可能引起HSP70表達(dá)水平發(fā)生變化。Ohnishi等[9]報(bào)道，搭乘NASA航天飛行器的金魚(yú)對(duì)微重力及空間輻射產(chǎn)生分子水平的應(yīng)激誘導(dǎo)反應(yīng)，多個(gè)臟器的HSP72水平明顯升高。劉春等[10]在大鼠心肌、血管組織的模擬失重實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，失重本身并不誘導(dǎo)大鼠心肌組織表達(dá)HSP70，但可誘導(dǎo)大鼠腦血管HSP70表達(dá)增加，而后肢血管的HSP70表達(dá)則下降。Ding等[11]進(jìn)行為期2個(gè)月的模擬失重研究，發(fā)現(xiàn)模擬失重環(huán)境中大鼠腎臟HSP70過(guò)表達(dá)，對(duì)抗訓(xùn)練能減少腎臟細(xì)胞凋亡，降低腎組織HSP70表達(dá)，進(jìn)而減輕失重造成的腎臟損傷。崔彥等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HSP70蛋白和mRNA在模擬失重大鼠肝組織中的表達(dá)表現(xiàn)為應(yīng)激早期升高、后期下降的特征。而失重情況下胰腺組織中HSP70表達(dá)的相關(guān)研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，尾懸吊模擬失重導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠胰腺組織尤其胰島細(xì)胞中HSP70蛋白表達(dá)發(fā)生明顯變化，胰島細(xì)胞核在模擬失重早期即出現(xiàn)深染，說(shuō)明失重對(duì)胰島細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成一定影響，這與文獻(xiàn)報(bào)道以及筆者前期研究發(fā)現(xiàn)失重大鼠血清胰島素短期內(nèi)升高、血糖波動(dòng)明顯的特點(diǎn)相符[13-16]。腺泡細(xì)胞的染色變化不及胰島細(xì)胞，亦與筆者前期研究發(fā)現(xiàn)血清淀粉酶和脂肪酶在模擬失重過(guò)程中僅呈一過(guò)性升高的特點(diǎn)有一定類同性[16]。顯然，HSP70在胰腺的失重應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，但具體機(jī)制和胰腺組織中各種類型細(xì)胞對(duì)模擬失重的各自反應(yīng)特點(diǎn)，尤其失重環(huán)境下胰島β細(xì)胞的功能變化和胰島素的代謝特性及機(jī)制尚需做深入的研究。

本研究結(jié)果還表明，大鼠胰腺組織中HSP70蛋白和mRNA的表達(dá)水平在尾懸吊早期即同步顯著上升，提示模擬失重是一種能誘導(dǎo)胰腺組織細(xì)胞表達(dá)HSP70的特殊而典型的應(yīng)激原。HSP70表達(dá)于模擬失重6 h形成高峰之后逐漸回落，其中HSP70 mRNA下降速度較快，幅度較大，而HSP70蛋白表達(dá)水平回落較慢，接近正常范圍時(shí)趨于穩(wěn)定。我們認(rèn)為，這一方面符合HSP70基因激活轉(zhuǎn)錄優(yōu)先并指令蛋白合成的規(guī)律，同時(shí)有可能存在HSP70 mRNA上下游基因信號(hào)調(diào)控的特殊機(jī)制。HSP70早期急劇升高、后期逐漸回落的現(xiàn)象表明其不但具有雙刃劍樣作用，還具有交叉耐受特性及記憶功能，其表達(dá)過(guò)程及水平與組織細(xì)胞應(yīng)激損傷和自身保護(hù)機(jī)制密切相關(guān)，同時(shí)HSP70形成的應(yīng)激耐力無(wú)特異性[6-7,17]。根據(jù)文獻(xiàn)和本研究結(jié)果推測(cè)，HSP70在胰腺的失重應(yīng)激損傷與失重應(yīng)激耐受或適應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，失重及非失重應(yīng)激原誘導(dǎo)HSP70表達(dá)均應(yīng)能提高失重應(yīng)激耐力，此機(jī)制的詮釋在失重訓(xùn)練和航天飛行中可能有重要意義。

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(本文編輯：呂芳萍)

歡迎訂閱《中華胰腺病雜志》

HSP70expressioninpancreasofratsundertheconditionofsimulatedweightlessness

LIUFei,ZHOUJin-lian,DUANYu-zhong,ZHANGShi-lin,YANGJian-wu,YANGHe-ming,LICheng-lin,CUIYan.

DepartmentofGeneralSurgery,The306HospitalofPLA,Beijing100101,China

CUIYan,Email：dryancui@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate Hsp70 expression features of rat′s pancreas under the condition of simulated weightlessness.MethodsTail-suspension method was used to simulate the weightlessness animal model. Sixty four adult male Wistar rats were randomly divided into 8 experimental groups (n=8)：suspended for 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7 d and control group. Hsp70 protein and mRNA in rat′s pancreas were detected by using immunohistochemical assay, Western blot and RT-PCR techniques.ResultsThe immunohistochemistry assay showed that Hsp70 protein was expressed in rats with tail-suspension, in particular the nuclei and cytoplasm of pancreatic islet cells were deeply stained in the early phase of suspension, but was not expressed in rats without tail-suspension. The expressions of Hsp70 protein were 0.881±0.013, 0.874±0.014, 0.865±0.014, 0.837±0.012 in 6 h, 12 h, 1 d, 2 d groups, which were significantly higher than those in control group (0.921±0.078,P<0.05)，and 0.862±0.042, 0.838±0.063, 0.807±0.071 in 3 d,5 d,7 d groups, which returned to the level of control group. The expressions of Hsp70 mRNA significantly increased at 6 h, and then gradually decreased, at 3 d they reached the lowest point (0.694±0.027), and they began to increase to 0.836±0.014 at 5 d and decrease to 0.674±0.013 at 7 d.ConclusionsThe simulated weightlessness has remarkable effect on the expressions of Hsp70 protein and mRNA in rat′s pancreas, and the expressions are up-regulated in the early phase and returns to normal level in the late phase.

Weightlessness simulated； Pancreas； HSP70 heat-shock proteins； Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.009

全軍醫(yī)學(xué)科研“十一五”后勤科研攻關(guān)項(xiàng)目(08G058)；全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J051)

100101 北京，解放軍第306醫(yī)院普通外科(劉飛、段育忠、張?jiān)娏?、楊建武、楊鶴鳴、李成林、崔彥)，病理科(周金蓮)

崔彥，Email:dryancui@yahoo.com.cn

2012-09-26)