劉海臣

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042）

向日葵屬于菊科一年生草本植物，具有耐鹽堿、抗干早、耐貧瘠等優(yōu)良特性，是植物油脂和蛋白質(zhì)的重要來源，同時，它也是重要的生物能源之一。向日葵很容易受農(nóng)桿菌侵染［1］，所以目的基因很容易通過農(nóng)桿菌進入向日葵的腫瘤細(xì)胞。向日葵遺傳工程獲得首例轉(zhuǎn)化植株報道的是利用下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的未知序列基因的轉(zhuǎn)化［2］，并且是用卡那霉素作為再生植株的篩選標(biāo)記。在向日葵遺傳轉(zhuǎn)化過程中，一些研究表明：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化向日葵受許多因素影響。這些因素包括外植體的生理年齡［3］、外植體的接種時間［4，5］、農(nóng)桿菌株［6］、共培養(yǎng)時間［3］、培養(yǎng)基中激素種類及濃度［7］、篩選劑的類型及濃度［8，9］和不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法［10，11］。

本試驗利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，研究了共培養(yǎng)時間、侵染時間、重懸液濃度等因素對向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與轉(zhuǎn)化受體

HA300、NC208、諾雜212三種基因型均由內(nèi)蒙古通遼市種子公司提供，以向日葵下胚軸為轉(zhuǎn)化受體。

1.1.2 質(zhì)粒和菌株

根癌農(nóng)桿菌EHA101由本實驗室保存，質(zhì)粒 （本室構(gòu)建）上含有目的基因Psy和植物抗性篩選標(biāo)記Hpt基因。

1.1.3 向日葵組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

向日葵下胚軸組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基，其成分見表1。

表1 向日葵下胚軸組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 潮霉素適宜篩選濃度試驗

將3個向日葵品種的下胚軸作為外植體，接種到含潮霉素分別為0、5、10、15、20mg／L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每一梯度每一品種接種外植體數(shù)10，各4次重復(fù)。2～3周后調(diào)查下胚軸的分化情況。

1.2.2 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化因素試驗

實驗中設(shè)置共培養(yǎng)時間、侵染時間、農(nóng)桿菌菌液濃度和干燥時間4個因子試驗，共培養(yǎng)時間設(shè)置5個處理 （1、2、3、4、5d）；侵染時間設(shè)5個梯度 （1、5、10、15、20min）；農(nóng)桿菌菌液濃度A600值分別為0.3、0.6、0.9、1.2；干燥處理時間為0、4、8h，干燥處理方法：將切割好的下胚軸放置在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在工作臺里放置，讓其自然干燥。以上每一梯度接種外植體數(shù)為48個。

1.2.3 試驗結(jié)果的調(diào)查與數(shù)據(jù)處理

外植體接種到含不同濃度的Hyg培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后調(diào)查下胚軸的芽誘導(dǎo)情況，并統(tǒng)計不定芽率，不定芽率 （%）＝發(fā)生不定芽的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)×100；侵染的外植體在脫菌篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周后，調(diào)查產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)，計算抗性芽誘導(dǎo)率，抗性芽誘導(dǎo)率 （%）＝抗性芽的外植體數(shù)／侵染的外植體數(shù)×100；抗性芽誘導(dǎo)率用SSPS（13.0版本）軟件進行方差分析與顯著性測驗。

1.3 植物材料的培養(yǎng)

取3個品種向日葵的種子，挑選粒大飽滿的在超凈工作臺上先用75%酒精浸泡1～2min，無菌水沖洗1～2次，然后用無菌水浸泡12h，再用0.1%升汞溶液浸泡10min，用無菌水沖洗3～4次，然后取出向日葵籽仁接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上，于25℃、無光照條件下培養(yǎng)。當(dāng)苗齡2～3d左右時，取無菌苗的下胚軸作為外植體用于轉(zhuǎn)化。

1.4 脫菌篩選培養(yǎng)

共培養(yǎng)3d后，將向日葵下胚軸轉(zhuǎn)移到脫菌篩選培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)抗性芽的產(chǎn)生。每天光照16h，溫度25℃，每15～20d天繼代一次，頭孢霉素濃度由300mg／L逐漸降低，以抑制住農(nóng)桿菌的生長為宜。篩選壓Hyg濃度由高到低，10～5mg／L。培養(yǎng)時以未作轉(zhuǎn)化的材料為對照。由于具有Hyg抗性的下胚軸在篩選培養(yǎng)基上能正常生長，并且在下胚軸處分化出綠色芽，而非抗性的小芽逐漸黃化、死亡。

1.5 抗性植株P(guān)CR檢測

PCR擴增的引物分別為：引物1：5＇—GAA TTC ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTT GTT—3＇，引物2：5＇—GC GGC CGC TCA TGT TTG GGG TAT CAT AAA AGA—3＇。按王關(guān)林的SDS方法提取植物基因組DNA，分別從抗性植株和未轉(zhuǎn)化對照植株葉片提取DNA作為模板，按94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min；61℃退火1min；72℃延伸1min。重復(fù)30個循環(huán)。最后72℃延伸11min的程序進行PCR擴增，質(zhì)粒為陽性對照，未轉(zhuǎn)化對照植株DNA為陰性對照。PCR反應(yīng)體系為25μL，模板DNA為1μL。擴增結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選劑潮霉素濃度的確定

從圖1可以看出，3種基因型（HA300、NC208和諾雜212）向日葵下胚軸對潮霉素的敏感性相似，均隨著潮霉素濃度的增加，出芽率呈下降趨勢。無潮霉素時芽的誘導(dǎo)率為68.9%，而當(dāng)加入不同濃度的潮霉素后對向日葵下胚軸芽的誘導(dǎo)卻有明顯的抑制作用，當(dāng)潮霉素濃度為15mg／L時，不定芽誘導(dǎo)率降為1.97%，且外植體開始變白、變褐并萎縮。對不同潮霉素濃度和向日葵品種的出芽率進行了方差分析可知，下胚軸出芽率在潮霉素的不同濃度處理間存在極顯著差異 （F＝247.2＞F0.01＝7.01）。10mg／L潮霉素時，下胚軸出芽率極顯著地低于對照，基本上完全抑制不定芽形成。因此，在遺傳轉(zhuǎn)化時，以10mg／L潮霉素作為選擇壓力。

圖1 不同潮霉素濃度對向日葵下胚軸誘導(dǎo)率的影響

2.2 共培養(yǎng)時間對抗性芽率的影響

圖2 共培養(yǎng)時間對向日葵子葉節(jié)抗性芽率的影響

農(nóng)桿菌侵染下胚軸后共培養(yǎng)時間試驗結(jié)果見圖2。由圖2可知，共培養(yǎng)時間對下胚軸抗性芽率的影響存在顯著差異，共培養(yǎng)時間3d的較1d的抗性芽率HA300提高了11.0%、諾雜212提高了7.8%、NC208提高了7.6%，3d的較5d的抗性芽率HA300 高 11.5%、 諾 雜 212 高11.0%、NC208高9.3%，且5個處理以共培養(yǎng)時間3d的抗性芽率最高。因此，確定向日葵下胚軸農(nóng)桿菌侵染后適宜的共培養(yǎng)時間為3d。

2.3 侵染時間對向日葵抗性芽誘導(dǎo)率的影響

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，菌液的浸染時間對轉(zhuǎn)化有一定的影響。農(nóng)桿菌侵染時間試驗結(jié)果 （圖3）表明，農(nóng)桿菌對HA300、NC208和諾雜212向日葵的下胚軸的侵染時間不同，下胚軸抗性芽率也存在差異，3個品種下胚軸的侵染時間以10min的抗性芽率最高，且顯著地高于1min和20min兩個處理。因此，確定農(nóng)桿菌侵染下胚軸的較適宜時間為10min。

圖3 侵染時間對抗性芽率的影響

2.4 重懸液的濃度對抗性芽的影響

以A600為0.3、0.6、0.9和1.2五種濃度的重懸液分別侵染向日葵HA300、NC208和諾雜212的下胚軸，5周之后調(diào)查抗性芽率 （圖4）。由圖4可知，當(dāng)菌液濃度達到0.6時，抗性芽率最高，隨著重懸液濃度的增加抗性芽率而減少。對不同重懸液濃度進行方差分析結(jié)果表明，不同重懸液間的抗性芽率存在極顯著差異 （F＝12.53＞F0.01＝4.76），但重懸液濃度A600為0.6和0.9之間的下胚軸抗性芽率差異不顯著。在試驗中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重懸液濃度增加時，雖然侵染機率很大，但是下一步抑菌工作帶來很大困難，而且對植物細(xì)胞的傷害也很大，導(dǎo)致相當(dāng)一部分細(xì)胞褐化、失去再生能力或死亡。因此我們選擇A600為0.6為侵染時所用重懸液濃度。

2.5 外植體干燥處理對抗性芽率的影響

細(xì)胞滲透壓的改變可以影響轉(zhuǎn)化效果，研究者通過添加甘露醇或山梨醇來改變植物細(xì)胞的滲透壓，來提高轉(zhuǎn)化效率。但通過對外植體干燥處理還未見報道。本試驗對侵染的向日葵下胚軸進行了4h和8h的干燥處理（圖5）。由圖5可知，向日葵品種HA300和NC208下胚軸4h干燥處理的抗性芽率，較不處理分別提高11.8%和19.6%，較8h處理分別高6.7%和10.7%，說明對預(yù)侵染的下胚軸進行適當(dāng)?shù)母稍锾幚碛兄诳剐匝柯实奶岣摺?/p>

圖4 農(nóng)桿菌重懸菌液濃度對抗性芽率的影響

2.6 抗性苗的PCR檢測

從抗性植株和未轉(zhuǎn)化對照植株葉片提取總DNA作為模板進行PCR擴增，未轉(zhuǎn)化苗為陰性對照，質(zhì)粒為陽性對照，以λDNA／EcoRⅠ＋HindⅢ 雙酶切DNA分子為標(biāo)準(zhǔn)分子量，電泳結(jié)果見圖6。圖6表明，轉(zhuǎn)基因苗和質(zhì)粒都在1.3kb附近擴增出特異條帶，而陰性對照苗卻未擴增出相應(yīng)的特異條帶，由此初步證實，目的基因Psy已轉(zhuǎn)入到向日葵中。本試驗共獲得向日葵抗性苗126株，經(jīng)PCR檢測得到4株轉(zhuǎn)基因向日葵苗，轉(zhuǎn)化率為3.2%。NC208得到1株，HA300得到3株，諾雜212未得到轉(zhuǎn)化株。

圖5 干燥時間對向日葵下胚軸抗性芽率的影響

3 討 論

3.1 篩選劑對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

遺傳轉(zhuǎn)化過程中，重要的一個環(huán)節(jié)是受體的抗性篩選。通過篩選那些未轉(zhuǎn)化的受體就會死亡，而已轉(zhuǎn)化的受體因有抗性而存活下來。一般的做法是，在繼代時去掉褐化或死亡的外植體，但我們在向日葵下胚軸抗性篩選時發(fā)現(xiàn)，抗性芽不但從綠色的愈傷組織上長出芽，而且會從褐化非常嚴(yán)重、看上去死亡的愈傷組織上長出，而這些芽很有可能發(fā)育成抗性的苗。這可能是由于轉(zhuǎn)化首先是對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，而不是組織；表現(xiàn)褐化的愈傷組織，是大多數(shù)的細(xì)胞死亡了，而個別抗性細(xì)胞仍還活著，只是被大量的褐化細(xì)胞包圍而難于生長。一旦去掉篩選劑，這些抗性細(xì)胞便進行生長發(fā)育，進而分化成苗。因此，褐化的下胚軸不要過早地丟棄。本實驗研究結(jié)果表明，不同的基因型對潮霉素的敏感性確實存在差別，潮霉素使用濃度為10mg／L最佳。此外，潮霉素的使用方式如篩選壓濃度宜由低到高還是由高到低，仍需進一步探索。

圖6 向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化的PCR檢測

3.2 共培養(yǎng)時間與侵染時間對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

向日葵下胚軸作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體，由于下胚軸是器官組織，且表面積較小，農(nóng)桿菌侵染時不易接觸到傷口細(xì)胞。因此，所需的侵染時間比其它組織，如愈傷、體細(xì)胞胚組織等要長。在本試驗確定10min為農(nóng)桿菌侵染下胚軸的較適宜時間。

農(nóng)桿菌對植物進行轉(zhuǎn)化時，必須在傷口部位存活16h以上，才能進行T－DNA的轉(zhuǎn)移。此期間涉及農(nóng)桿菌向受傷部位的附著，Vir區(qū)基因的誘導(dǎo)活化及T－DNA的轉(zhuǎn)移整合。因此，需要較長的共培養(yǎng)時間，但在實際操作中，共培養(yǎng)時間也不宜太長，如果共培養(yǎng)時間太長，農(nóng)桿菌過度生長，不僅造成脫菌困難，還會使下胚軸受到毒害，不定芽形成困難或褐化死亡。本試驗確定向日葵下胚軸農(nóng)桿菌侵染的共培養(yǎng)時間為3d。

3.3 外植體干燥處理對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

細(xì)胞滲透壓的改變可以影響轉(zhuǎn)化效果，研究者通過添加甘露醇或山梨醇來改變植物細(xì)胞的滲透壓，來提高轉(zhuǎn)化效率。本研究試圖通過對下胚軸干燥處理來改變細(xì)胞的滲透壓，進而提高抗性芽率。試驗表明，對下胚軸進行適當(dāng)?shù)母稍锾幚碛欣诳剐匝柯实奶岣?。以干燥處?h的下胚軸為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化，下胚軸抗性芽率較不處理有明顯的提高。

4 小 結(jié)

建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化體系，適宜的菌液濃度A600為0.6、侵染時間為10min、共培養(yǎng)時間為3d、篩選劑潮霉素的濃度為10mg／L，下胚軸干燥處理時間4h有利于向日葵的遺傳轉(zhuǎn)化。

［1］Braun A C.Development of secondary tumors strands in the crown gall of sunflower［J］.Phytopathology，1941，31：135-149.

［2］Everett N P，Robinson K E P，Mascarenhas D.Genetic engineering of sunflower（Helianthus annuus L.）［J］.Biotechnology，5：1987，1201-1204.

［3］Schrammeijer B，Sijmons P C，van den Elzen P J M，et al.Meristem transformation of sunflower via Agrobacterium［J］.Plant Cell Rep，1990，9：55-60.

［4］Knittel N，Gruger V，Hahne G，et al.Transformation of sunflower（Helianthus annuus L.）：A reliable protocol［J］.Plant Cell Rep，1994，14：81-86.

［5］Grayburn W S，Vick B A.Transformation of sunflower（Helianthus annuus L.）following wounding with glass beads［J］.Plant Cell Rep，1995，14：285-289.

［6］Bidney D，Scelonge C，Martich J，et al.Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens［J］.Plant Mol Biol，1992，18：301-313.

［7］Burrus M，Rousselin P，Knittel N，et al.Transformation of sunflower：an overview of different approaches，their difficulties，how to overcome them，and first results［A］.Proceeding 14th International Sunflower Conference［C］.Beijing／Shenyang：Sunflower Association，1996：1064-1068.

［8］Escandón AS，Hahne G.Genotype and composition of culture medium are factors important for transformed sunflower（Helianthus annuus L）callus［J］.Physiol Plant，1991，1：367-376.

［9］Pugliesi C，Biasini M G，F(xiàn)ambrini M，et al.Genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens in the interspecific hybrid Helianthus annuus x Helianthus tuberosus［J］.Plant Sci，1993，93：105-115.

［10］Moyne A L，Tagu D，Thor V，et al.Transformation calli obtained by direct gene transfer into sunflower protoplast［J］.Plant Cell Rep，1989，8：97-100.

［11］Laparra H，Burrus M，Huonold R，et al.Expression of foreign genes in sunflower（Helianthus annuus L.）evaluation of three gene transfer methods［J］.Euphytica，1995，85：63-74.