孔 霞， 尚九龍， 李 麗， 吳孟晏， 別延紅， 顧帝水△

(廣東醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室， 2生理學(xué)教研室， 3病理學(xué)教研室， 廣東 東莞 523808)

口蝦蛄提取物對人鼻咽癌細(xì)胞遷移和體外血管生成擬態(tài)的抑制作用*

孔 霞1， 尚九龍2， 李 麗3， 吳孟晏3， 別延紅3， 顧帝水1△

(廣東醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2生理學(xué)教研室，3病理學(xué)教研室， 廣東 東莞 523808)

目的研究口蝦蛄提取物(extract ofOratosquilla，EOS)對人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2的遷移及體外血管生成擬態(tài)的影響。方法用不同濃度(0 mg/L 、125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L)EOS處理CNE-2細(xì)胞24 h后，創(chuàng)傷修復(fù)實驗檢測細(xì)胞遷移能力；通過Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)觀察CNE-2細(xì)胞形成類血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力及其特點；體外管道形成抑制實驗檢測不同濃度EOS對CNE-2細(xì)胞管道形成能力的影響；Western blotting法檢測不同濃度EOS對CNE-2細(xì)胞fascin 1和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果EOS可以顯著降低CNE-2細(xì)胞的遷移能力，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；CNE-2細(xì)胞在Matrigel上培養(yǎng)能形成類似血管的網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)；EOS能以劑量依賴方式抑制CNE-2細(xì)胞體外管道形成的數(shù)量(P<0.01)；EOS能抑制CNE-2細(xì)胞中fascin 1和VEGF蛋白的表達(dá)(P<0.01)，且其管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量與2種蛋白變化趨勢呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論CNE-2細(xì)胞具有血管生成擬態(tài)的能力；EOS能夠抑制CNE-2細(xì)胞的遷移和體外血管生成擬態(tài)的能力，其機(jī)制可能與下調(diào)fascin 1和VEGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。

口蝦蛄； 鼻咽腫瘤； 血管生成擬態(tài)

血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)是指一些高度惡性和侵襲性的腫瘤細(xì)胞具有模擬內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的特異性能力[1]。VM 與人們所熟悉的內(nèi)皮依賴性血管生成不同，它的管道內(nèi)沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞的覆蓋，取而代之的是一層腫瘤細(xì)胞，故它的彈性和通透性等特性與正常血管不同[2]，更有利于腫瘤細(xì)胞的快速生長和轉(zhuǎn)移。我們前期研究表明口蝦蛄提取物(extract ofOratosquilla,EOS)可能具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移及抑制腫瘤新生血管形成等作用[3-5]。本研究旨在進(jìn)一步探索口蝦蛄提取物對人低分化鼻咽癌CNE-2細(xì)胞體外遷移和腫瘤血管生成擬態(tài)的影響，以深入探討口蝦蛄提取物的抗腫瘤作用。

材 料 和 方 法

1材料

口蝦蛄提取物及人低分化鼻咽癌細(xì)胞系(CNE-2)均由廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)由香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；二甲基亞砜(DMSO, Sigma)；Matrigel購自威格拉斯(Vigorous)生物技術(shù)(北京)有限公司；鼠抗fascin 1和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)單克隆抗體 (Santa Cruz)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) CNE-2及HUVECs均采用含 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.2EOS的配制及實驗分組 EOS以DMSO溶解，實驗分4組：實驗前將溶解后的EOS加入各組細(xì)胞培養(yǎng)液中，使其終濃度分別為0 mg/L(對照組)、125 mg/L(低濃度組)、250 mg/L(中濃度組)和500 mg/L(高濃度組)，并使各組DMSO終濃度均為0.1%。

2.3創(chuàng)傷修復(fù)實驗檢測細(xì)胞遷移能力 用記號筆在6孔板背面劃上間隔0.5 cm的均勻橫劃線。將5×105個CNE-2細(xì)胞接種于6孔板，約90%融合生長后，用10 μL 移液器槍頭在孔的底部垂直于背面的橫線進(jìn)行劃痕，然后用PBS溶液洗去損傷脫落細(xì)胞3次。每孔加含EOS 0 mg/L、125 mg/L、250 mg/L和500 mg/L的RPMI-1640培養(yǎng)液2 mL，每組設(shè)3個平行孔，即刻攝像記錄。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按標(biāo)記再次同視野分別攝像記錄。應(yīng)用Scion Image 圖像處理軟件處理結(jié)果。按下式計算創(chuàng)口愈合面積百分比：創(chuàng)口愈合面積百分比=(0 h創(chuàng)口面積-24 h創(chuàng)口面積)/0 h創(chuàng)口面積×100%。以創(chuàng)口愈合面積百分比代表細(xì)胞平行遷移率。實驗重復(fù)3 次。

2.4體外管道形成實驗 將預(yù)冷過夜的Matrigel 膠加入96孔板(50 μL/well)，平整鋪于孔底，4 ℃冰箱放置15 min，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱凝固1 h；取對數(shù)生長期的HUVECs和CNE-2單細(xì)胞懸液，分別接種到已包被Matrigel膠的96孔板上(1×104cells/well) ，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；觀察細(xì)胞管狀排列情況及完整程度，終止管道形成后，棄上清液、PBS清洗、4%多聚甲醛固定20 min，顯微鏡下(×100)在事先標(biāo)記好的上、下、左、右、中心5個視野拍照，并計數(shù)5個視野的管狀結(jié)構(gòu)總個數(shù)。實驗重復(fù)3次。

2.5體外管道形成抑制實驗 在已包被Matrigel膠(方法同上)的96孔板中，每孔分別加入100 μL含1×104個CNE-2細(xì)胞懸液，分別加入100 μL含不同濃度EOS(0 mg/L、125 mg/L、250 mg/L和500 mg/L)含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，每組設(shè)3個平行孔。細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)、觀察、拍照、計數(shù)方法與2.4相同。實驗重復(fù)3次。

2.6Western blotting檢測fascin 1和VEGF的表達(dá) 將對數(shù)生長期的CNE-2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度為5×104cells/well，每孔1.8 mL。置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后加入200 μL含EOS的生長液，使各組EOS終濃度分別為0 mg/L、125 mg/L、250 mg/L和500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取 1×106個細(xì)胞以細(xì)胞裂解液裂解，沸水變性3～5 min，超聲波粉碎30 s，13 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進(jìn)行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，膜與鼠抗fascin 1和VEGF單克隆抗體4 ℃孵育過夜，再與羊抗鼠IgG 室溫孵育2 h，ECL檢測，β-actin作為內(nèi)參照。圖像經(jīng)Scion Image軟件進(jìn)行吸光度分析，并與內(nèi)參照β-actin比較，以相對吸光度值代表蛋白表達(dá)量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，處理組與對照組間比較采用LSD法，相關(guān)性分析采用Spearman 等價相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1EOS對CNE-2細(xì)胞遷移能力的影響

圖1顯示，對照組24 h后的創(chuàng)口愈合面積約較24 h 前縮小89.3%。EOS在濃度0～500 mg/L范圍內(nèi)能夠呈劑量依賴性抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的平行遷移能力，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，當(dāng)EOS為500 mg/L時24 h后的創(chuàng)口愈合面積僅為30%左右,且各組CNE-2細(xì)胞平均遷移速度與EOS濃度呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

Figure 1. Effect of EOS on the migration ability of CNE-2 cells (×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L;##P<0.01vs125 mg/L;▲▲P<0.01vs250 mg/L．

圖1EOS對CNE-2細(xì)胞遷移能力的影響

2EOS對CNE-2細(xì)胞體外管道形成能力的影響

HUVECs細(xì)胞能夠在人工基底膜膠上形成小管樣結(jié)構(gòu)，相互交織成網(wǎng)，見圖2A。而CNE-2細(xì)胞也能夠模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性，呈現(xiàn)長梭樣的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞之間互相連接，6 h后形成血管網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)，形成過程與內(nèi)皮細(xì)胞相似，見圖2B。對照組所形成的管道結(jié)構(gòu)排列整齊且較多而完整，呈單個環(huán)狀或多個環(huán)相連的網(wǎng)格狀，見圖2B；經(jīng)不同濃度EOS處理的CNE-2細(xì)胞在Matrigel膠上形成的小管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目較對照組減少，且環(huán)狀結(jié)構(gòu)斷裂，見圖2C，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CNE-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度EOS處理后管道形成的數(shù)目與EOS濃度呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

3EOS對CNE-2細(xì)胞中fascin1和VEGF蛋白表達(dá)的影響

圖3所示，EOS作用于CNE-2細(xì)胞24 h后，隨著EOS濃度的增加，fascin 1和VEGF蛋白的表達(dá)逐漸下降(P< 0.01)，且其變化趨勢與EOS對細(xì)胞遷移能力和VM的變化趨勢均呈正相關(guān)(P<0.05)。

Figure 2. Effect of EOS on the vasculogenic mimicry of CNE-2 cells (24 h,×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L;##P<0.01vs125 mg/L;▲▲P<0.01vs250 mg/L．

圖2EOS對CNE-2細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響

Figure 3. Effects of EOS on the expression of fascin 1 and VEGF in CNE-2 cells.1: 0 mg/L; 2: 125 mg/L； 3: 250 mg/L； 4: 500 mg/L.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs1;##P<0.01vs2;▲▲P<0.01vs3．

圖3EOS對CNE-2細(xì)胞fascin1和VEGF表達(dá)的影響

討 論

實體瘤需要血液供應(yīng)才能維持生長和發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。長期以來，人們一直認(rèn)為腫瘤血管生成是其獲得血液供應(yīng)的唯一途徑。直到1999年Maniotis 等[1]在研究葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時發(fā)現(xiàn)了另一種獨特的腫瘤血液供應(yīng)方式，即惡性黑色素瘤細(xì)胞可通過自身變形，形成可輸送血液的管道結(jié)構(gòu)——VM。該類管道的特點是管道內(nèi)沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，腫瘤細(xì)胞模仿機(jī)體血管生成而形成瘤細(xì)胞條索并圍成管道。該管道外周是一層厚薄不一的過碘酸-雪夫氏反應(yīng)(periodic acid-Schiff, PAS)陽性物質(zhì)構(gòu)成的基底膜。這種結(jié)構(gòu)更有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。后來，人們逐漸在卵巢癌、肝癌、胃腺癌、乳腺癌[6-8]中發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)現(xiàn)象，但是目前關(guān)于血管生成擬態(tài)在鼻咽癌中的報道還比較少。

本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞在Matrigel膠上能夠形成小管樣結(jié)構(gòu)，說明CNE-2細(xì)胞可能具有類似內(nèi)皮細(xì)胞的某些功能和生物學(xué)行為，在體外能夠模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性，具有血管生成擬態(tài)的能力。這與文獻(xiàn)報告高度惡性、侵襲性的腫瘤細(xì)胞能夠形成血管生成擬態(tài)相一致[9-10]。CNE-2細(xì)胞形成的小管樣結(jié)構(gòu)經(jīng)不同濃度的EOS藥物干預(yù)后，其小管樣結(jié)構(gòu)形成能力明顯受到抑制，而且環(huán)狀結(jié)構(gòu)斷裂、不完整，高濃度組作用最明顯，表明EOS能夠抑制CNE-2細(xì)胞血管生成擬態(tài)的能力，且有明顯的劑量依賴性。

惡性腫瘤細(xì)胞能夠模擬內(nèi)皮細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)的機(jī)制仍處于研究階段。目前研究認(rèn)為VM可能與VE-cadherin、EphA2、laminin 5 γ2、MMP-2、PI3K、HIF-1α、Notch、 Mig-7和VEGF-C等[11-12]相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Western blotting結(jié)果顯示EOS能明顯抑制CNE-2細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)，且其變化趨勢與EOS對VM的影響趨勢具有相關(guān)性(P<0.01)，這說明EOS可能通過抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞VEGF的表達(dá)影響VM的形成。

本實驗中利用創(chuàng)傷修復(fù)實驗來研究EOS對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的體外遷移能力，結(jié)果顯示，EOS能夠顯著降低CNE-2細(xì)胞的體外遷移能力，并且與EOS對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2中fascin 1蛋白表達(dá)的影響具有相關(guān)性。Fascin作為細(xì)胞骨架蛋白，在許多上皮來源的(如肺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌及食管癌等)腫瘤細(xì)胞系及腫瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)，而在相應(yīng)的正常上皮低表達(dá)或不表達(dá)，參與了腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移[13-15]，提示EOS可能通過抑制CNE-2細(xì)胞中fascin 1蛋白的表達(dá)來降低CNE-2細(xì)胞的遷移能力，從而降低腫瘤細(xì)胞通過血管或淋巴管轉(zhuǎn)移及局部浸潤的機(jī)會，減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，EOS能夠抑制CNE-2細(xì)胞的遷移能力和微血管形成能力，其作用機(jī)制可能與EOS能顯著抑制CNE-2細(xì)胞中fascin 1和VEGF的表達(dá)有關(guān)。

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InhibitoryeffectofextractofOratosquillaonmigrationandvasculogenicmimicryinhumannasopharyngealcarcinomacelllineinvitro

KONG Xia1, SHANG Jiu-long2, LI Li3, WU Meng-yan3, BIE Yan-hong3, GU Di-shui1

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofPhysiology,3DepartmentofPathology,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China.E-mail:gudishui@163.com)

AIM: To study the inhibitory effect of the extract ofOratosquilla(EOS) on the migration and vasculogenic mimicry in human poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2.METHODSCNE-2 cells were cultured in the medium with different concentrations of EOS (0 mg/L, 125 mg/L, 250 mg/L and 500 mg/L). The migration of CNE-2 cells and the formation of tube-like structures (TLSs) by CNE-2 cells were determined with wound healing assay andinvitroanti-angiogenesis test, respectively. The formation of TLSs by CNE-2 cells and their structural characteristics were observed by anti-angiogenesis test on the Matrigel. The protein expression of fascin 1 and vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected by Western blotting.RESULTSCompared with control group, EOS significantly decreased the migration velocity of CNE-2 cells in a dose-dependent manner. CNE-2 cells formed TLSs on the Matrigel, and the formation of TLSs by CNE-2 cells was inhibited by EOS in a dose-dependent manner. The expression of fascin 1 and VEGF in CNE-2 cells was also decreased after treatment with EOS. A positive correlation between the expression of fascin 1/VEGF and the formation of TLSs by CNE-2 cells was observed.CONCLUSIONCNE-2 cells form TLSs on the Matrigel, and EOS inhibits the migration and vasculogenic mimicry of CNE-2 cells, which are related with down-regulating the expression of fascin 1 and VEGF in CNE-2 cells .

Oratosquilla; Nasopharyngeal neoplasms; Vasculogenic mimicry

R739.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.012

1000- 4718(2013)06- 1025- 04

2013- 01- 14

2013- 04- 25

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項目(No.B2011235)；廣東省中醫(yī)藥管理局資助課題(No.20122082)；東莞市高等院校科研計劃(No.200910815267)

△通訊作者 Tel： 0759-22896324； E-mail: gudishui@163.com