高洪泉 張愛清 田忠富

·論著·

三氧化二砷與順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)人卵巢癌HO8910細胞凋亡的初步研究

高洪泉 張愛清 田忠富

目的探討三氧化二砷與順鉑聯(lián)合對體外培養(yǎng)卵巢癌細胞株HO8910細胞增殖、細胞周期調(diào)控及細胞凋亡影響。方法用三氧化二砷與順鉑聯(lián)合處理HO8910 細胞，采用MTT法檢測藥物對細胞的抑制作用，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)改變；瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA降解，以及應(yīng)用流式細胞儀觀察細胞凋亡過程中細胞周期的變化。結(jié)果在三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用下，HO8910 細胞呈凋亡改變，DNA瓊脂糖凝膠電泳呈典型的凋亡特征。細胞凋亡的同時，細胞周期發(fā)生特定的改變。結(jié)論三氧化二砷與順鉑聯(lián)合能抑制卵巢癌細胞增殖，能誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡。

三氧化二砷(As2O3)；順鉑(DDP)； 細胞凋亡；卵巢癌細胞株

卵巢癌是是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤。眾多研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與細胞分化異常增殖過度有關(guān)，而且與細胞凋亡有關(guān)[1]。隨著人們對細胞凋亡機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)許多化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮抗癌效應(yīng)的。因此探索藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，將成為腫瘤治療的新方向。本文探討三氧化二砷與順鉑聯(lián)合對體外培養(yǎng)卵巢癌細胞株HO8910細胞凋亡的作用[2]。

1 材料和方法

1.1材料及儀器 人卵巢癌細胞系HO8910購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所。三氧化二砷購自哈醫(yī)大第一附屬醫(yī)院，順鉑購于錦州制藥一廠。RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Promega公司生產(chǎn)。使用前加小牛血清至10%，青霉素，鏈霉素至100 U/ml。流式細胞儀(FCM)為美國Coulter公司生產(chǎn)。碘化丙啶(PI)為美國Sigma公司生產(chǎn)。酶聯(lián)免疫檢測儀為美國Bio-TEK(型號EL-312E)產(chǎn)品。主要試劑為： EDTA[150 mmol NaCl加25 mmol 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)]；TBE緩沖液(89 mmol Tris 加 80 mmol硼酸，再加2.5 mmol EDTA)；1.5%瓊脂糖凝膠(TBE緩沖液 100 ml加入 2g 瓊脂糖加熱融化)及10%十二烷基硫酸鈉(SDS)(10 g SDS加水至100 ml)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人卵巢癌細胞HO8910培養(yǎng)于含有10%小牛血清，100U/ml青霉素、鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2MTT試驗 藥物組為DDP濃度為4 μmol/L，As2O3濃度分別為1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L共4組，用培養(yǎng)液稀釋，卵巢癌細胞以103/ml接種于4塊進口96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL培養(yǎng)液，每天用一塊。每組設(shè)4個復(fù)孔，接種后24 h更換培養(yǎng)液。實驗組加入各濃度藥物培養(yǎng)液，對照不加藥，空白對照不加培養(yǎng)液，加藥后分別于24、48、72、96 h加入20 μlMTT，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育4 h后吸出培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO震蕩溶解10 min，空白對照調(diào)零，酶聯(lián)儀檢測，波長490 nm，測定各孔的吸光值。計算抑制率，抑制率=[(陰性對照組OD值-實驗組OD值)/陰性對照組OD值] ×100%。

1.2.3形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)加藥組和未加藥組細胞形態(tài)變化情況。

1.2.4DNA Ladder測定 常規(guī)消化收集細胞，PBS洗一遍，按試劑盒步驟裂解細胞，RNase作用，蛋白沉淀，提取DNA，液氮中凍5 min，70%酒精洗DNA，真空抽干，溶于TE緩沖液中，常規(guī)1.5%瓊脂糖電泳，電壓60 v，電泳2 h，觀察，照相。

1.2.5流式細胞術(shù)測定 取指數(shù)生長期細胞，采用PI檢測法，藥物作用48 h后，常規(guī)消化收集細胞，1000 r/min離心5 min，PBS洗兩遍，重懸細胞于PBS中調(diào)整細胞濃度為106/ml，加RNase及PI，避光4℃染色30 min，上機檢測。激發(fā)波長488 nm，檢測3×104個細胞，用ModiFit軟件分析

2 結(jié)果

2.1MTT試驗結(jié)果 各濃度組藥物對HO-8910卵巢癌細胞株均有明顯的抑制增殖作用，同陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具有量效和時效關(guān)系，抑制率同作用時間呈直線相關(guān)(P<0.01)。培養(yǎng)基DDP濃度為4 μmol/L，As2O3濃度分別為1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L。其中2 μmol/L組在12、24、36、48、60小時抑制率分別為10.3%、22.6%、34.7%、47.5%、51.9%，8 μmol/L組在12、24、36、48、60 h抑制率分別為16.3%、37.5%、53.2%、82.3%，其中以8μmol/L作用60小時為最高(82.3%)(圖1)。

圖1 不同濃度藥物作用下卵巢癌細胞抑制率變化

2.2形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下每日觀察對照組和各實驗組細胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度和時間增加，低濃度三氧化二砷與順鉑聯(lián)合和高濃度三氧化二砷與順鉑聯(lián)合對卵巢癌細胞作用不同，主要表現(xiàn)在：⑴對卵巢癌細胞貼壁能力和集落性影響不同，2 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用72 h后，細胞貼壁能力稍下降，極少細胞脫落，細胞生長呈集落性；8 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用24 h即可見細胞貼壁能力明顯下降，許多細胞脫落成漂浮生長狀態(tài)，隨作用時間延長， 脫落細胞逐漸增多，至60 h約有70%～80%的細胞呈懸浮生長，48 h時可見細胞集落生長特性明顯降低，細胞開始呈單個生長狀態(tài)，60h90%以上細胞呈單個生長狀態(tài)。⑵細胞大小和形狀變化：2 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用72 h后，細胞稍變小，大多數(shù)細胞應(yīng)呈梭形，部分細胞變圓，8 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用24 h時可見大多數(shù)細胞變圓變小，隨時間延長改變明顯，72小時所有細胞RNase大小和形狀同未加藥的卵巢癌細胞完全不同(圖2)。

圖2A 正常卵巢癌細胞(10 ×10倍)

圖2B 2 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h卵巢癌細胞(10 ×10倍)

圖2C 8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用24 h卵巢癌細胞(10 ×10倍)

圖2D 8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h卵巢癌細胞(10 ×10倍)

2.3DNA Ladder測定 2 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h未見DNA Ladder出現(xiàn)，8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h時可見 DNA Ladder出現(xiàn)(圖3)。

圖3 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖3A:DNA Marker 圖3B:2 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h卵巢癌細胞 圖3C:8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用24 h卵巢癌細胞 圖3D:8 μmol/L三氧化二砷與4 μmol/L順鉑聯(lián)合作用作用48 h卵巢癌細胞

2.4流式細胞測定結(jié)果 經(jīng)濃度為2、8 μmol/L三氧化二砷與順鉑聯(lián)合分別作用48 h，可見亞G1峰出現(xiàn)，而對照組未見亞G1峰；藥物組S+ G2～M期細胞所占比例較對照組明顯增高，且隨濃度增高而增高；低濃度和高濃度及對照組在凋亡率、細胞周期上的差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4A 圖4A 正常卵巢癌細胞

3 討論

As2O3、DDP對卵巢癌細胞均有誘導(dǎo)凋亡作用[3]。但單用時都需較高濃度才能達到理想效果。而DDP在治療劑量內(nèi)仍對人體有嚴重的腎毒性和骨髓抑制等不良反應(yīng)。因此選擇最低有效劑量的DDP應(yīng)用于臨床,對降低其毒副作用具有非常重要的意義。本實驗發(fā)現(xiàn)As2O3、DDP聯(lián)合作用時癌細胞的凋亡率明顯高于單藥組,表明兩者有協(xié)同作用。特別是當As2O3濃度為8 μmol/L、DDP濃度為4 μmol/L時,癌細胞幾乎全部死亡,大大高于相應(yīng)單藥組[4]。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅同腫瘤細胞的增殖和分化異常有關(guān)，而且同細胞凋亡基因的變化有關(guān)。因此，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡成為近年來腫瘤治療方面的重點。細胞凋亡時的特點主要為形態(tài)和生化方面的改變，細胞體積變小，染色體凝聚成新月狀，出現(xiàn)凋亡小體等特點；同時染色體由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用產(chǎn)生180～200 bp的梯狀片斷。本組研究中不同濃度三氧化二砷與順鉑聯(lián)合均可抑制卵巢癌細胞增殖，且有時效和量效關(guān)系，抑制率以8 μmol/L、DDP濃度為4 μmol/L為最高。倒置顯微鏡下有細胞凋亡的早期形態(tài)改變，但在低濃度時未觀察到出現(xiàn)，DNA凝膠電泳表現(xiàn)出典型的“梯形”條帶，流式細胞儀檢測有細胞凋亡峰出現(xiàn)[5]。

通過以上觀察結(jié)果，三氧化二砷與順鉑聯(lián)合可誘導(dǎo)卵巢癌細胞株凋亡的作用是肯定的，但與濃度有關(guān)。低濃度抑制細胞增殖并不是通過細胞凋亡實現(xiàn)，其機制有待于探討。進一步分析三氧化二砷與順鉑聯(lián)合對卵巢癌細胞株周期的影響發(fā)現(xiàn)，其可阻滯細胞于S+ G2～M期，且在8 μmol/L、DDP濃度為4 μmol/L后隨濃度增加抑制率并不增加，表明三氧化二砷與順鉑聯(lián)合作用的細胞周期動力學(xué)機制可能為周期特異性藥物，提示在應(yīng)用時合用對S及 G2～M期敏感的藥物可能有助于提高療效[6]。

綜上所述，三氧化二砷與順鉑聯(lián)合可以誘導(dǎo)卵巢癌細胞株HO8910的凋亡，但存在濃度差異，在低濃度時抑制細胞增殖但沒有啟動凋亡，但在高濃度時抑制細胞凋亡為主；并使細胞周期阻滯于S+ G2～M期，這為進一步動物實驗及其進一步的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)[7]。

[1] 高洪泉,王英,鄭海興.苦參素誘導(dǎo)卵巢癌HO8910細胞凋亡.中醫(yī)藥學(xué)報，2004,32(6)：10-12.

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StudiesonArsenictrioxideandCisplatininducesapoptosisinOvarianCancercelllinesHO8910

GAOHong-quan，ZHANGAi-qing，TIANZhong-fu.
XiamenMedicalCollage157011，China

ObjectiveThe current study was designed to investigate whether Arsenic trioxide and Cisplatin can induces apoptosis in Ovarian Cancer cell.MethodsCell proliferation was assessed by MTT assays.Morphological changes of apoptosis were observed with invert microscope . DNA ladder and cell cycle were examined by DNA agarose gel eletronphores and PI fluorescence flow cytometry(FCM).ResultsUnder the influence of Arsenic trioxide and Cisplatin, HO8910 cell exhibited changes of apoptosis both in morphology and in the characteristics of electrophoresis.Meanwhile the cell cycle also showed special change.ConclusionArsenic trioxide and Cisplatin can inhibit cell proliferation, Arsenic trioxide and Cisplatin can induces apoptosis in Ovarian Cancer cell.

Arsenic trioxide； Cisplatin； apoptosis； Ovarian Cancer cell line

福建省教育廳基金資助項目(項目編號：2011)；廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基金項目(項目編號：2009)

361008 廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校