胡桂萍 ，賈憲波 ，劉波 ，尤民生

1.福建農(nóng)林大學(xué) 應(yīng)用生態(tài)研究所，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003

芽胞桿菌（Bacillus spp.）為好氧或兼性厭氧的桿菌，一般為革蘭染色陽性，對高溫、放射線和有毒有害化學(xué)物質(zhì)等外界有害因子有很強的抵抗力，廣泛分布于土壤、水、空氣及動物腸道等處。芽胞桿菌處于不良環(huán)境時，細菌細胞質(zhì)高度濃縮脫水形成芽胞，這是一種抗逆性很強的球形或橢圓形的休眠體，休眠體內(nèi)富含大量耐熱的小分子酶類、特殊的吡啶二羧酸鈣和帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，且具有多層次厚而致密的芽胞壁，代謝作用緩慢，卻具有潛在的萌發(fā)力，是抗逆性最強的生命體[1]。

研究表明，芽胞桿菌芽胞的形成、強抗逆性及高抗病性都與其胞內(nèi)相關(guān)蛋白的調(diào)控表達有關(guān)。如SpoIIE蛋白在芽胞隔膜形成的主要作用因子通過激活轉(zhuǎn)錄因子Sigma F，誘導(dǎo)特異性前孢子的表達[2]。炭疽芽胞桿菌（B.anthracis）中的Spo0B具有組氨酸激酶和ATP酶活性，通過核苷二磷酸激酶表達誘導(dǎo)核苷三磷酸核苷二磷酸脫磷酸，從而調(diào)控芽胞初始形成過程及抗病作用[3]。嗜冷芽胞桿菌（B.psychro?saccharolyticus）中的Hsp33蛋白具有調(diào)控有機溶劑降解基因的作用[4]。通過低溫誘導(dǎo)高溫厭氧細菌嗜熱脂肪芽胞桿菌（B.stearothermophilus）TLS33可得到葡糖基轉(zhuǎn)移酶、抗Sigma B因子、Mrp蛋白質(zhì)同簇體、二氫乳清酸酶、FeuA-SigW基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器、RibT蛋白質(zhì)、磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶和特異性前孢子轉(zhuǎn)錄RsfA激酶共8個相關(guān)蛋白，但其中6個參與了芽胞桿菌芽胞形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]。重組蘇云金芽胞桿菌（B.thuringiensis）中SLH-Ap36融合蛋白的表達可增強其抗病性[6]。芽胞桿菌產(chǎn)芽胞過程中還伴隨產(chǎn)生大量代謝物、酶類、伴胞晶體等，這些物質(zhì)對環(huán)境中的污染物[7]、有機物和害蟲等具有降解和毒害作用[8,13-15]。因此，加大對芽胞桿菌蛋白質(zhì)的研究力度和深度，有助于芽胞桿菌資源的開發(fā)和利用。

芽胞桿菌胞壁較厚，易形成芽胞，蛋白提取過程中存在細胞壁破碎困難、破碎不完全、蛋白提取率低等問題，故應(yīng)進行蛋白破碎提取方法的摸索。我們以具有農(nóng)藥降解和生物修復(fù)功能的巨大芽胞桿菌（B.megaterium）、球形芽胞桿菌（B.sphaericus）和彎曲芽胞桿菌（B.flexus）為材料，比較了沸水浴、超聲波和機械破碎作用下提取的菌體蛋白的含量和質(zhì)量，建立了芽胞桿菌菌體蛋白高效破碎提取方法，為進一步深入研究上述3種芽胞桿菌的農(nóng)藥降解機理奠定了基礎(chǔ)，也可為類似革蘭陽性菌菌體蛋白的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

巨大芽胞桿菌、球形芽胞桿菌、彎曲芽胞桿菌是本實驗室研究人員從菊酯類農(nóng)藥土中篩選到的菊酯類農(nóng)藥降解菌。SDS（十二烷基磺酸鈉），丙烯酰胺，Bis（N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺），Tris（三羥甲基氨基甲烷），甘氨酸，鹽酸，過硫酸氨，TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量標準，溴酚藍，甘油，冰醋酸，乙醇，β-巰基乙醇，考馬斯亮藍R250，甲醇，乙醇。iMark680酶標儀、Bio-Rad小垂直板電泳儀（Bio-Rad公司）；ImageScannerIII掃描儀（GE公司）；SPW-10TJ型超低細菌型超純水器（上海賽鴿電子科技有限公司）。

1.2 菌體培養(yǎng)

從-80℃冰箱中取出巨大芽胞桿菌和球形芽胞桿菌菌種，在含農(nóng)藥甲黃?。∕SM）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上活化[9]，置30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)入含農(nóng)藥MSM的液體培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min培養(yǎng)10 h，4℃、6000 r/min離心10 min，收集菌體；用10倍體積的0.85%生理鹽水懸浮菌體，10 000 r/min、4℃離心10 min，清洗培養(yǎng)基中的雜蛋白，重復(fù)3次。

1.3 蛋白破碎提取

1.3.1 沸水浴破碎提取法 取2 mL細菌懸液，加入0.1 g/mL SDS溶液2 mL，沸水浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液貯存于-20℃。

1.3.2 超聲波破碎提取法 取2 mL細菌懸液，置冰浴中超聲波破碎，超聲波功率為500 W，工作3 s、間歇2 s，破碎30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液貯存于-20℃。

1.3.3 機械破碎提取法 取1 g濕菌體中加入10 mL裂解液并使其懸浮，加入少量玻璃珠，采用QIA?GEN tissuselyserⅡ破碎儀破碎5 min，頻率為30/s，10 000 r/min離心10 min，取上清液貯存于-20℃。

1.4 細菌裂解程度觀察

分別取破碎后的菌懸液，稀釋，涂片，固定，進行革蘭染色，于100倍油鏡下觀察，并采集觀察結(jié)果。

1.5 蛋白的SDS-PAGE

采用Bio-Rad小垂直板電泳儀對蛋白樣品進行SDS-PAGE，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%。采用銀染法進行凝膠染色，凝膠用Epson Ex?pression 10000XL掃描儀掃描，用Quantity One軟件進行圖像分析。

1.6 蛋白含量測定

用改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定可溶性全細胞蛋白。采用酶標法，分別配置蛋白含量為0、100、150、200、250、300 μg/L時，考馬斯亮藍G-250與蛋白結(jié)合物的D595nm值與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可用于測定蛋白質(zhì)含量。考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量的標準曲線方程為A=0.0022C+0.3136（r2=0.9912），其中A為吸光度值，C為蛋白濃度?？扇苄匀毎鞍滋崛×坑脝挝惑w積（mL）菌液中所含的蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg）表示。

2 結(jié)果

2.1 不同破碎方法下芽胞桿菌的破碎程度分析

與對照相比，巨大芽胞桿菌、球形芽胞桿菌和彎曲芽胞桿菌經(jīng)沸水浴、玻璃珠機械破碎和超聲波破碎后，都出現(xiàn)了不同程度的菌體碎片，但破碎程度差異明顯。玻璃珠機械破碎對3種芽胞桿菌細胞的破壞程度最強，完整形態(tài)細胞最少；超聲波破碎對細胞的破壞程度稍弱；而沸水浴對細胞形態(tài)的破壞最差，完整結(jié)構(gòu)的細胞數(shù)量最多。

2.2 不同破碎方法獲得的芽胞桿菌菌體蛋白的SDS-PAGE分析

芽胞桿菌菌體蛋白的SDS-PAGE圖譜見圖2，用不同破碎方法得到的蛋白圖譜存在差異。機械破碎提取的蛋白圖譜條帶最多，最為清晰，著色較深，菌株重復(fù)性很好。巨大芽胞桿菌的蛋白譜帶為30～32條，相對分子質(zhì)量（Mr）為16×103～200×103；球形芽胞桿菌蛋白譜帶為 24～26條，Mr為 18×103～190×103；彎曲芽胞桿菌蛋白譜帶為 28～31 條，Mr為 18×103～180×103。超聲波破碎提取的蛋白條帶較模糊，效果不穩(wěn)定，重復(fù)性不好。用該方法提取的巨大芽胞桿菌的蛋白譜帶為 15～20 條，Mr為 15×103～180×103；球形芽胞桿菌蛋白譜帶為13～15條，Mr為18×103～160×103；彎曲芽胞桿菌蛋白譜帶為 13～15 條，Mr為 20×103～150×103。沸水浴提取的蛋白圖譜不僅條帶少、很模糊，同時重復(fù)性很差。

2.3 不同破碎方法獲得的芽胞桿菌菌體蛋白的濃度比較

將D600nm為2.0的3種細菌菌液各取50 mL，比較不同破碎方法獲得的菌體蛋白的濃度，結(jié)果見表1。機械破碎方法得到的3種細菌的蛋白濃度均為最高，巨大芽胞桿菌、球形芽胞桿菌、彎曲芽胞桿菌蛋白濃度分別為20.247、19.902和18.893 mg/mL；其次是超聲波破碎提取的菌體蛋白濃度，依次分別為10.572、9.438和 10.424 mg/mL；沸水浴破碎提取的效果最差，蛋白提取率很低，蛋白濃度依次僅分別為1.366、1.119和1.136 mg/mL。

3 討論

雖然已有很成熟的蛋白提取方法，但從極端環(huán)境中分離的芽胞桿菌具有抗逆和易產(chǎn)芽胞的特點，實驗室常規(guī)方法不一定適用。因此，針對產(chǎn)芽胞這一類革蘭陽性菌，直接使用某一常規(guī)方法提取蛋白常得不到理想結(jié)果[17-18]。蛋白提取的關(guān)鍵步驟是細胞破碎和蛋白質(zhì)溶解，不同破碎方法提取的蛋白質(zhì)效果不同[10]。細菌裂解后釋放至胞體內(nèi)及膜上的蛋白質(zhì)比例與裂解程度相關(guān)，裂解率越高，釋放的蛋白質(zhì)頁越多，此時細胞結(jié)構(gòu)越不完整，可通過細胞染色電鏡觀察來指示細胞的破碎程度[11]。

表1 不同破碎方法所得菌體蛋白的濃度

圖1 不同破碎方法處理的芽胞桿菌革蘭染色（×1000）

圖2 不同破碎方法提取的芽胞桿菌蛋白質(zhì)的SDS-PAGE

細菌細胞破碎方法主要有超聲波、高壓勻漿、研磨、高速珠磨、酶溶、有機溶劑滲透、低滲裂解等[16-18]，各具優(yōu)劣。酶溶、有機溶劑滲透、低滲裂解主要是加入一些降解細胞壁成分的物質(zhì)，如溶菌酶等，有很好的裂解作用，但容易將外源蛋白引入樣本，影響樣本蛋白質(zhì)的后期分析；而超聲波、高壓勻漿、研磨、高速珠磨方法主要通過機械方式破壞細胞壁，不會將外源物質(zhì)引入樣本，有利于蛋白質(zhì)組的研究，但裂解程度一般[12]。巨大芽胞桿菌和球形芽胞桿菌為革蘭陽性菌，細胞壁難以破碎，因此宜采用較為劇烈的方法裂解。本實驗分別采用超聲波、沸水浴和玻璃珠機械破碎法提取芽胞桿菌蛋白，通過SDS-PAGE分析和Bradford法定量，發(fā)現(xiàn)用玻璃珠機械破碎方式提取的蛋白濃度高，重復(fù)性好。與其他方法相比，用玻璃珠機械破碎方式得到的蛋白條帶多，譜圖全，提取率高。用超聲波破碎芽胞桿菌，存在超聲聲頻和聲能及超聲時間的影響，頻率太低超聲空化引起的沖擊波和剪切力不足，芽胞桿菌細胞壁破碎不徹底，蛋白提取不充分；超聲強度太大，容易使溶液產(chǎn)生泡沫，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。沸水浴易使蛋白變性，即使細胞破碎完全，蛋白的提取率還是很低。因此，通過玻璃珠機械破碎提取芽胞桿菌的蛋白質(zhì)效果最好，可用于芽胞桿菌等革蘭陽性菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

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