劉潛 ，付潔 ，宋海峰

1.中南大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410010；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類起重要調(diào)控作用的非編碼小分子RNA。研究表明，miRNA-靶基因、miRNA-miRNA之間形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，處于關(guān)鍵調(diào)節(jié)樞紐的miRNA有望成為疾病治療的靶標(biāo)[1]或作為未來(lái)診斷疾病的有效生物標(biāo)志物[2-3]。成熟miRNA具有以下特點(diǎn)：片段小，一般為18～25 nt；種類多，最新miRbase 18.0數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄18 226條前體 miRNA與 21 643條成熟miRNA（http://www.mir?base.org）[4-5]；差異小，miRNA家族成員之間通常只相差一個(gè)堿基；表達(dá)水平低，相對(duì)于mRNA的表達(dá)量來(lái)說(shuō)，miRNA的表達(dá)水平低。

針對(duì)miRNA基礎(chǔ)研究與后續(xù)藥物研發(fā)的4個(gè)主要不同階段（確定候選miRNA，miRNA時(shí)間/空間的表達(dá)差異，miRNA機(jī)理研究，miRNA候選藥物研究），我們著重闡述不同階段所普遍采用的先進(jìn)分析技術(shù)：候選miRNA研究的克隆測(cè)序類技術(shù)；miRNA表達(dá)譜高通量芯片技術(shù)；目的miRNA及其前體表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和Northern印跡技術(shù)；miRNA類核酸藥物的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)。

1 候選miRNA克隆測(cè)序類技術(shù)

克隆測(cè)序最早用于miRNA的分析和監(jiān)測(cè)，尤其是對(duì)于未知序列miRNA的確定，為發(fā)現(xiàn)新的候選miRNA提供基礎(chǔ)。最初的克隆測(cè)序方法首先需要對(duì)miRNA進(jìn)行cDNA的文庫(kù)構(gòu)建，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后克隆到表達(dá)載體中，最后進(jìn)行測(cè)序，該方法需要較大的初始樣本（幾百微克RNA）[8]。隨后Takada建立了一種快速擴(kuò)增克隆法[9]，可以在較少樣本量的時(shí)候極大地提高miRNA檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，但通量不夠（5種miRNA/反應(yīng)）。Cummins在該方法的基礎(chǔ)上研制出標(biāo)簽序列克隆法[10]，將通量大大提高（35種miRNA/反應(yīng)），并被首次成功地應(yīng)用于描繪成年小鼠睪丸和卵巢miRNA表達(dá)水平譜。

隨著RNA組學(xué)研究的開展，上述方法面對(duì)組織中海量的miRNA仍顯低效，新一代大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)應(yīng)運(yùn)而生，如Roche Applied Science公司的454基因組測(cè)序技術(shù)、Illumina公司和Solexa technol?ogy公司合作開發(fā)的Illumina測(cè)序技術(shù)、Applied Bio?systems公司的 SOLiD（supported oligonucleotide li?gation and detection）測(cè)序技術(shù)等[11-12]。新型高通量測(cè)序技術(shù)均基于一種新的測(cè)序策略，即循環(huán)芯片測(cè)序法（cyclic-array sequencing），即對(duì)布滿樣品的芯片重復(fù)進(jìn)行基于聚合酶反應(yīng)（模板變性、引物退火雜交及延伸）及熒光序列讀取反應(yīng)。該策略通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)miRNA的標(biāo)簽序列和出現(xiàn)頻率，達(dá)到尋找和發(fā)現(xiàn)新miRNA的目的，能同時(shí)測(cè)定幾百種miRNA。Il?lumina基因組分析儀測(cè)定讀長(zhǎng)為50 nt，采取每次反應(yīng)封閉3'端，使反應(yīng)中只能加入1個(gè)核苷酸，同時(shí)每次延伸都將上一步反應(yīng)試劑清洗，因此具有所需樣品少、數(shù)據(jù)誤差小、操作流程簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。SOLiD系統(tǒng)的測(cè)定讀長(zhǎng)為35 nt，在測(cè)序過(guò)程中每個(gè)堿基在2個(gè)連接反應(yīng)過(guò)程中分別被測(cè)定，即每個(gè)堿基會(huì)被檢測(cè)2次，準(zhǔn)確度高，單次運(yùn)行所得數(shù)據(jù)量大，適于miRNA的研究。Roche 454基因組測(cè)序儀測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)400～500堿基，而miRNA序列長(zhǎng)度僅為22堿基，所以該測(cè)序儀常用于新物種的基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，極少用于miRNA測(cè)序[13]。Schotte等運(yùn)用Solexa深度測(cè)序技術(shù)對(duì)70個(gè)病例中的7種兒科急性成淋巴性白血病的miRNA譜進(jìn)行繪制，發(fā)現(xiàn)了28種新的miRNA及431種候選新miRNA，為兒科急性成淋巴性白血病中miRNA功能研究奠定了基礎(chǔ)[14]。Liu等用454基因組測(cè)序技術(shù)和SOLiD深度測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)化過(guò)程中miRNA參與新生組織的功能[12]。目前主要用克隆測(cè)序方法中的Illumina和SOLiD技術(shù)來(lái)重點(diǎn)解決對(duì)未知序列miRNA的初步了解及其初步表達(dá)情況的問(wèn)題，為挖掘新miRNA奠定基礎(chǔ)。

2 miRNA表達(dá)譜的高通量分析技術(shù)

研究者須進(jìn)一步研究目的miRNA（已知序列）的時(shí)相性和空間性及表達(dá)水平差異，因此miRNA芯片技術(shù)得以開發(fā)和應(yīng)用。miRNA芯片技術(shù)主要包括固相微陣列芯片和液相芯片技術(shù)。固相微陣列芯片的主要原理為：在玻璃片或尼龍膜等固體支持物上固定高密度已知序列的DNA捕獲探針，利用雜交原理使多種標(biāo)記了的miRNA目標(biāo)分子與捕獲探針雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度及數(shù)據(jù)處理，獲得不同標(biāo)本中特異miRNA的表達(dá)譜，從而全面比較不同物種的不同器官或組織及正常和患病組織中miRNA表達(dá)水平的差異。根據(jù)所用的不同的標(biāo)記試劑，可分為同位素標(biāo)記檢測(cè)[15]、熒光標(biāo)記檢測(cè)[16]、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記檢測(cè)[17]和納米粒子標(biāo)記檢測(cè)[18]。固相微陣列技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于能夠迅速和高通量地確定miRNA表達(dá)譜，但其問(wèn)題在于不同檢測(cè)探針與待測(cè)物之間會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，因此實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精密度較差，且制作和檢測(cè)費(fèi)用高。

Luminex-xMAP液態(tài)芯片技術(shù)則是一種基于微球雜交的流式細(xì)胞檢測(cè)方法（bead-based hybridiza?tion technology），它可以對(duì)同一個(gè)微量樣本中的多個(gè)不同miRNA分子快速定量。其基本原理：首先采取逐步降溫雜交法，使目標(biāo)序列miRNA與生物素標(biāo)記的互補(bǔ)探針雜交，隨后使特定編碼的磁性微球與復(fù)合探針雜交，每一個(gè)特定編碼微球?qū)?yīng)相應(yīng)的探針，在此過(guò)程中，未形成雙鏈的游離探針、非特異結(jié)合到探針上的miRNA和其他單鏈RNA會(huì)被相應(yīng)的單鏈酶降解；最后加入鏈親和素-藻紅素?zé)晒鈭?bào)告分子，與復(fù)合探針上的生物素結(jié)合，在報(bào)告激光的作用下產(chǎn)生報(bào)告熒光，報(bào)告熒光物質(zhì)和微球內(nèi)的編碼熒光物質(zhì)分別受到定量激光激發(fā)和定性激光激發(fā)，激發(fā)后光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)的分析處理，確定微球結(jié)合的分析物的定性和定量信息。與微陣列芯片相比，Luminex-xMAP液態(tài)芯片技術(shù)中的微球處于液相懸浮狀態(tài)，其微球表面固定的探針類似于液相探針，更有利于捕獲待測(cè)靶miRNA序列，且運(yùn)用單鏈核酸酶能最大程度地避免固態(tài)芯片中的交叉反應(yīng)，克服了微陣列芯片的不足。Lu[19-20]等較早應(yīng)用該方法確定了人類腫瘤樣本（肝癌、直腸癌、胰腺癌及胃癌）的miRNA表達(dá)譜。由于Luminex既具有高通量、快速、微量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，又具有在同一個(gè)試驗(yàn)樣品中同時(shí)檢測(cè)不同目標(biāo)物的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于研究同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)不同miRNA的相對(duì)表達(dá)。

3 目標(biāo)miRNA和前體表達(dá)的定量技術(shù)

獲得目標(biāo)miRNA（hit-miRNA）后，須對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究。反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）和Northern印跡可以對(duì)成熟和前體miRNA進(jìn)行定量。目前RT-qPCR策略主要有以下3種：引物延伸法[21]、polyA加尾法和莖環(huán)PCR法。由于該類方法通常需要基于U6等內(nèi)參基因校正，且無(wú)須明確miRNA的絕對(duì)量，屬于相對(duì)定量范疇。

引物延伸法和polyA加尾法均基于特殊的酶連反應(yīng)，使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在序列長(zhǎng)度上增長(zhǎng)且包含特定序列，利用針對(duì)特定序列的引物進(jìn)行后續(xù)qPCR擴(kuò)增。但這2種方法中T4DNA連接酶的連接效率和連接作用可能改變其原本的序列，成為影響靈敏度和特異性的關(guān)鍵[7]。

莖環(huán)PCR法不需要酶連反應(yīng)，僅通過(guò)對(duì)miRNA序列特異互補(bǔ)的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和通用TaqMan探針即可定量，且具有良好的特異性和靈敏度。雖然TaqMan探針需要專門設(shè)計(jì)和合成，成本較高，不適合一次檢測(cè)多個(gè)miRNA，但該方法逐漸成為miRNA相對(duì)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，為研究miRNA的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和機(jī)制闡述提供了有利工具。為進(jìn)一步增強(qiáng)qPCR方法的定量能力，Li等設(shè)計(jì)了一種更加巧妙的莖環(huán)探針來(lái)代替通用的莖環(huán)探針，由于采用了2個(gè)互補(bǔ)的莖環(huán)探針，相對(duì)于僅采用3'端莖環(huán)的探針?lè)ǎ摲椒ㄟM(jìn)一步提高了特異性，已用于檢測(cè)4種miRNA在小鼠10種組織中的相對(duì)表達(dá)量，為癌癥的臨床診斷和研究提供了有利的工具。

qPCR不僅可對(duì)成熟miRNA進(jìn)行定量，也可用于前體miRNA表達(dá)譜的分析。Chugh等建立了一種基于SYBR的qPCR方法，對(duì)miRNA前體和成熟體進(jìn)行檢測(cè)，即主要采用全自動(dòng)機(jī)器操作PCR整個(gè)流程和選取具有相同退火溫度的186對(duì)引物，以便在同一塊板上用相同的優(yōu)化條件進(jìn)行定量，從而探究miRNA的產(chǎn)生機(jī)制。Baker等[25]運(yùn)用分子信標(biāo)方法，在短時(shí)間（20～30 min）內(nèi)通過(guò)相對(duì)定量可確定細(xì)胞和組織液中成熟miRNA及其前體表達(dá)水平。其主要原理：分子信標(biāo)與靶標(biāo)RNA發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開（從而淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)分離），在激發(fā)光作用下產(chǎn)生熒光信號(hào)。Baker等運(yùn)用該方法對(duì)miR-21及其前體的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，以探究同種miRNA與其前體之間的關(guān)系。

Northern印跡是檢測(cè)miRNA的經(jīng)典方法[26]，適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。該方法可有效檢測(cè)成熟與前體miRNA表達(dá)水平，但靈敏度低、定量范圍窄、總RNA樣品需求量大及放射性32P的使用等限制了其應(yīng)用范圍。為此，研究者進(jìn)行了一系列改良：如采用鎖核酸探針替代傳統(tǒng)探針以提高靈敏度[27-28]；用地高辛（DIG）標(biāo)記替代放射性磷標(biāo)記，在保證靈敏度的前提下增加實(shí)驗(yàn)的安全性；用EDC（1-乙基-3-二甲基丙胺-碳化二亞胺）促進(jìn)RNA分子轉(zhuǎn)膜[29]。Kim[30]綜合利用各種措施，使得Northern印跡檢測(cè)miRNA的定量下限為0.05 fmol/L，大幅提高了定量范圍和靈敏度。改良Northern印跡檢測(cè)法不僅有利于miRNA及其前體的相關(guān)研究，也有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作成本和環(huán)境的控制。

對(duì)目標(biāo)miRNA表達(dá)的定量方法還有其他多種，例如引物入侵法[31]、納米金標(biāo)法[32]、納米金銀染倍增法[33]、單分子檢測(cè)法[34]、直接與間接電化學(xué)法[35-36]、光電共振法[37-38]。上述方法盡管各有特點(diǎn)，但整體而言，由于缺乏微陣列芯片和Luminex等技術(shù)的高通量特性、qPCR技術(shù)的高靈敏度與成熟性及Northern印跡的廣泛適用性，其應(yīng)用尚有較大限制，需要進(jìn)一步的探索和改進(jìn)。

4 miRNA藥物的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)

目前miRNA作為治療劑已進(jìn)入應(yīng)用階段，已有研究表明通過(guò)拮抗miRNA對(duì)從病毒感染到癌癥均有良好的藥理治療作用，相對(duì)大多數(shù)作用于mRNA的反義藥物來(lái)說(shuō)，作用于miRNA的藥物能更加精確，且能作用于有相同種子序列的基因家族[39]。研究表明，多種拮抗miRNA的antimiR藥物在動(dòng)物模型體內(nèi)顯示出良好的藥理作用[40]。Miravirsen（MIR）是第一個(gè)獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的該類藥物，現(xiàn)處于臨床Ⅱ期試驗(yàn)階段。MIR是miRNA-122的拮抗模擬類似物，用于治療丙肝病毒（HCV）感染[41-42]。隨著miRNA類核酸藥物時(shí)代的開啟，旨在闡明miRNA藥物作為治療劑的體內(nèi)過(guò)程及作用機(jī)制的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)顯得格外重要。miRNA藥物的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)分析技術(shù)不同于前述定量技術(shù)，通常要求對(duì)生物基質(zhì)中的miRNA藥物直接定量檢測(cè)，屬于絕對(duì)定量分析，能更真實(shí)地反映體內(nèi)的過(guò)程。

目前miRNA藥物的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)主要為雜交酶聯(lián)免疫法。Kenneth等通過(guò)雜交酶聯(lián)免疫對(duì)血漿和細(xì)胞裂解液中甲基磷酸化修飾的miRNA進(jìn)行定量分析[43]。該方法是利用序列特異性捕獲探針與目標(biāo)miRNA雜交，并與地高辛標(biāo)記的檢測(cè)探針形成復(fù)合體，通過(guò)顯色系統(tǒng)進(jìn)行定量。目前該方法對(duì)甲基磷酸化修飾的miRNA的定量范圍為10 pmol/L～1 μmol/L。Wang[44]等利用這種超靈敏的方法，評(píng)價(jià)了2′-MeOPSmiR16-1、2′-MeOPSmiR29和2′-MeOP?SantagomiR155等3種修飾后miRNA的盒式給藥（cassette dosing）（又稱組合給藥）情況下，在血漿、外周血細(xì)胞及骨髓組織中的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合多種miRNA給藥的方式能延長(zhǎng)各自末端半衰期，且能夠提高藥效，為miRNA的類似物或拮抗劑作為臨床治療藥物的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，MIR的藥代動(dòng)力學(xué)研究也采用該方法完成[45]。

5 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)miRNA各自特點(diǎn)和應(yīng)用情況，目前miRNA分析方法可簡(jiǎn)要概括如表1。準(zhǔn)確、科學(xué)的定性和定量分析方法是闡明miRNA調(diào)節(jié)機(jī)制的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是以miRNA作為生物標(biāo)志物進(jìn)行診斷的前提，更是以其作為核酸類藥物評(píng)價(jià)不可或缺的部分?；诓煌芯磕康牡膍iRNA檢測(cè)分析方法的建立與合理應(yīng)用具有重要意義。因此，對(duì)傳統(tǒng)分析方法進(jìn)行改良，開發(fā)全新分析技術(shù)，以達(dá)到高靈敏、高通量、樣品需求量小、低成本的要求，是未來(lái)miRNA分析技術(shù)發(fā)展的方向。

表1 miRNA定量方法的特點(diǎn)和應(yīng)用

[1]Dacic S,Kelly L,Shuai Y,et al.miRNA expression profiling of lung adenocarcinomas:correlation with mutational status[J].Modern Pathol,2010,23:1577-1582.

[2]Mattie M D, Benz C C,Bowers J,et al.Optimized highthroughput microRNA expression profiling provides novel bio?marker assessment of clinical prostate and breast cancer bi?opsies[J].Mol Cancer,2006,5:24.

[3]Wang Yong,Zheng Dali,Tan Qiulin,et al.Nanopore-based detection of circulating microRNAs in lung cancer patients[J].Nat Nanotechnol,2011,6:668-674.

[4]Kozomara A,Griffiths-Jones S.miRBase:integrating miRNA annotation and deep-sequencing data[J].Nucleic Acids Res,2010,39:D152-D157.

[5]Andreasen D,Fog J U,Biggs W,et al.Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples[J].Methods,2010,50:S6-S9.

[6]Chen C.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2005,33:e179-e179.

[7]Chen J,Lozach J,Garcia E W,et al.Highly sensitive and specific microRNA expression profiling using BeadArray tech?nology[J].Nucleic Acids Res,2008,36:e87.

[8]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].Curr Biol,2002,12:735-739.

[9]Takada S, Yamashita Y,Berezikov E,et al.Mouse miRNA profiles determined with a new and sensitive cloning method[J].Nucleic Acids Res,2006,34:e115.

[10]CumminsJM.ThecolorectalmicroRNAome[J].ProcNatl Acad Sci USA,2006,103:3687-3692.

[11]Morozova O,Marra M A.Applications of next-generation se?quencing technologies in functionalgenomics[J].Genomics,2008,92:255-264.

[12]Blythe M J,Malla S,Everall R,et al.High through-put se?quencing of the parhyale hawaiensis mRNAs and microRNAs to aid comparative developmental studies[J].PLoS ONE,2010,7:e33784.

[13]TANG Hai-Ming,CHEN Hong,ZHANG Jing,et al.Applica?tion of next generation sequencing in microRNA detection[J].Hereditas,2010,34(6):784-792.

[14]Schotte D,Akbari Moqadam F,Lange-Turenhout E A,et al.Discoveryofnew microRNAsbysmallRNAomedeepse?quencing in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Leuke?mia,2011,25(9):1389-1399.

[15]Krichevsky A M,King K S,Donahue C P,et al.A miRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development[J].RNA,2003,9(10):1274-1281.

[16]Nelson P T,Baldwin D A,Scearce L M,et al.Microar?ray-based,high-throughput gene expression profiling of mi?croRNAs[J].Nature Methods,2004,1(2):155-161.

[17]CissellK A,RahimiY,Shrestha S,etal.Biolumines?cence-based detection of microRNA,miR21 in breast cancer cells[J].Anal Chem,2008,80(7):2319-2325.

[18]Liang Ru-Qiang,Li Wei,Li Yang,et al.An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on label?ing RNA with quantum dot and nanogold probe[J].Nucleic Acids Res,2005,33(2):e17.

[19]Dunbar S A.Applications of Luminex xMAP technology for rapid,high-throughput multiplexed nucleicacid detection[J].Clin Chim Acta,2006,363:71-82.

[20]Lu J,Getz G,Miska E A,et al.MicroRNA expression pro?files classify human cancers[J].Nature,2005,435:834-838.

[21]Raymond C K.Simple,quantitative primer-extension PCR as?say for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs[J].RNA,2005,11:1737-1744.

[22]Shi R,Chiang V.Facile means for quantifying microRNA ex?pression by real-time PCR[J].BioTechniques,2005,39:519-525.

[23]Li J,Yao B,Huang H,et al.Real-time polymerase chain re?action microRNA detection based on enzymatic stem-loop probes ligation[J].Anal Chem,2009,81:5446-5451.

[24]Chugh P,Tamburro K,Dittmer D P.Profiling of pre-micro RNAs and microRNAs using quantitative real-time PCR(qP?CR)arrays[J].J Vis Exp,2010,3(46):e2210.

[25]Baker M B,Bao G,Searles C D.In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons[J].Nucleic Acids Res,2011,40:e13.

[26]Calin G A.Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocyt?ic leukemia[J].Proc NatlAcad SciUSA,2002,99:15524-15529.

[27]Braasch D A,Corey D R.Locked nucleic acid(LNA)finetuning the recognition of DNA and RNA[J].Chem Biol,2001,8:1-7.

[28]Levin J D,Fiala D,Samala M F,et al.Position-dependent ef?fects of locked nucleic acid(LNA)on DNA sequencing and PCR primers[J].Nucleic Acids Res,2006,34:e142.

[29]Pall G S,Codony-Servat C,Byrne J,et al.Carbodiimide-me?diated cross-linkingof RNA tonylon membranesimproves the detection of siRNA,miRNA and piRNA by northern blot[J].Nucleic Acids Res,2007,35:e60.

[30]Kim S W,Li Z,Moore P S,et al.A sensitive non-radioac?tive northern blot method to detect small RNAs[J].Nucleic Acids Res,2010,38:e98.

[31]Allawi H T.Quantitation of microRNAs using a modified in?vader assay[J].RNA,2004,10:1153-1161.

[32]Fang Shiping,Lee H J,Wark A W,et al.Attomole microar?ray detection of microRNAs by nanoparticle-amplified SPR im?aging measurements of surface polyadenylation reactions[J].J Am Chem Soc,2006,128:14044-14046.

[33]Yang W J,Li X B,Li Y Y,et al.Quantification of miRNA by gold nanoparticle probes[J].Anal Biochem,2008,376:183-188.

[34]Neely L A,Patel S,Garver J,et al.A single-molecule meth?od for the quantitation of microRNA gene expression[J].Nat Methods,2006,3:41-46.

[35]Fan Y,Chen X,Trigg A D,et al.Detection of microRNAs using target-guided formation of conducting polymer nanow?ires in nanogaps[J].J Am Chem Soc,2007,129:5437-5443.

[36]Soleymani L,Fang Zhichao,Sargent E H,et al.Programming the detection limits of biosensors through controlled nanostruc?turing[J].Nat Nanotechnol,2009,4:844-848.

[37]Washburn A L,Luchansky M S,Bowman A L,et al.Quanti?tativelabel-free detection offive protein biomarkersusing multiplexed arrays of silicon photonic microring resonators[J].Anal Chem,2010,82:69-72.

[38]Qavi A J,Kindt J T,Gleeson M A,et al.Anti-DNA:RNA antibodies and silicon photonic microring resonators:increased sensitivity for multiplexed microRNA detection[J].Anal Chem,2011,83:5949-5956.

[39]van Rooij E,Olson E N.MicroRNA therapeutics for cardiovas?cular disease opportunities and obstacles[J].Nat Rev Drug Dis?cov,2012,11(11):860-872.

[40]Stenvang J,Petri A,Lindow M,et al.Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides[J].Silence,2012,3:1.

[41]Lindow M,Kauppinen S.Discovering the first microRNA-tar?geted drug[J].J Cell Biol,2012,199:407-412.

[42]Hildebrandt-Eriksen E S, Aarup V, Persson R, et al. A locked nucleic acid oligonucleotide targeting microRNA 122 is well-tolerated in cynomolgus monkeys[J].Nucleic Acid Ther,2012,22(3):152-161.

[43]Chan K K,Liu Zhongfa,Xie Zhiliang,et al.A novel ultrasen?sitive hybridization-based ELISA method for 2-methoxyphos?phorothiolate microRNAs and its in vitro and in vivo applica?tion[J].AAPS J,2010,12(4):556-568.

[44]Wang H,Chiu M,Xie Z,et al.Synthetic microRNA cassette dosing:pharmacokinetics,tissue distribution and bioactivity[J].Mol Pharm,2012,9(6):1638-1644.

[45]Hu Jun,Xu Yaxing,Hao Junli,et al.MiR-122 in hepatic function and liver diseases[J].Protein Cell,2012,3(5):364-371.

[46]Lehmann U,Streichert T,Otto B,et al.Identification of differ?entially expressed microRNAs in human male breast cancer[J].BMC Cancer,2010,10:109.

[47]Jonstrup S P.A microRNA detection system based on pad?lock probes and rolling circle amplification[J].RNA,2006,12:1747-1752.