韓傳銀 ，張飛雄 ，童貽剛

1.首都師范大學(xué)，北京 100048；

2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

近年來，日益增加的抗生素耐藥性使我們對細(xì)菌性感染疾病的治療越來越困難，而且新型抗生素研發(fā)的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及耐藥細(xì)菌出現(xiàn)的速度，耐藥菌對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，耐藥問題已成為全球共同關(guān)注的重大難題之一[1]，迫使人類重新審視抗生素的使用，尋找其替代品已刻不容緩。噬菌體因具有嚴(yán)格的專一性和對宿主菌的裂解能力，再次獲得科學(xué)家的重視[2]。噬菌體有十分嚴(yán)格的宿主特異性，這使噬菌體產(chǎn)品對人、動物、植物和環(huán)境（包括細(xì)菌生態(tài)環(huán)境）具有較高的安全性[3]。由于噬菌體可以采用活噬菌體制劑，這些活的噬菌體會在合適的宿主細(xì)菌中大量繁殖，因此噬菌體產(chǎn)品往往只需很小的使用劑量，并且只需要一次性用藥，即可經(jīng)過增殖放大殺滅所有敏感細(xì)菌。目前關(guān)于噬菌體治療的報道也越來越多[4-6]，但有關(guān)噬菌體分離與濃縮方法的報道相對較少。我們從PEG沉淀、PEG反透析、陰陽離子結(jié)合樹脂、超濾等5種方法[7-8]入手，對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的T4、N4、T7等3類噬菌體進(jìn)行了濃縮對比試驗(yàn)，并對濃縮效果較好的PEG反透析進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

IMEO8（T4類噬菌體）、IME11（N4類噬菌體）由本實(shí)驗(yàn)室分離[9]，T3噬菌體（T7類噬菌體）標(biāo)準(zhǔn)株購自ATCC；上述噬菌體均經(jīng)羅氏454測序鑒定。陰陽離子結(jié)合樹脂（QSepharoseXL、SPSepharoseXL）購自GE公司；半透膜（MW8000～14000，77 mm）購自Sig?ma公司；Amicon Ultra-15離心超濾管（截留分子量100kD）、PEG8000購自AMRESCO公司。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，pH7.0（固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉，半固體培養(yǎng)基加0.8%瓊脂粉）；121℃高壓滅菌20 min。

SM 緩沖液：NaCl 5.8 g，MgSO42.0 g，1 mol/L Tris-HCl（pH7.5）50 mL，2%明膠5 mL，加水至1 L。

1.2 噬菌體濃縮

1.2.1 離子結(jié)合樹脂濃縮 噬菌體表面有很多蛋白，呈現(xiàn)兼性離子的特征，故可與帶電荷的樹脂進(jìn)行交換吸附，再用高濃度的NaCl進(jìn)行洗脫。向1 L樣本中加入100 μL陰離子結(jié)合樹脂QSepharoseXL或陽離子結(jié)合樹脂SPSepharoseXL，于磁力攪拌器上低速攪拌0.5 h，使噬菌體與樹脂充分結(jié)合，然后靜置0.5 h，10 000 ×g離心10 min，小心地將上清液倒掉，用1 mL 1 mol/L的NaCl將沉淀吹打懸浮，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PEG沉淀 PEG8000是一種很黏稠的高度網(wǎng)狀聚合物，可將病毒沉淀下來。向樣本中加固體PEG至終濃度為10%，室溫下用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解PEG，將噬菌體/PEG溶液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中冰浴，至少放置1 h，以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀；4℃、11 000 ×g離心10 min，去上清，將離心管倒置傾斜放5 min，以便使剩余液體充分流干，用移液器吸去殘余液體，用帶橡皮球的寬口吸管將噬菌體沉淀輕輕地重懸于SM緩沖液中，將離心管傾斜放置，使SM緩沖液完全覆蓋并浸泡噬菌體沉淀，室溫放置1 h；加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的PEG和細(xì)胞碎片，溫和振蕩30 s；4℃、3000 ×g離心15 min，回收含噬菌體顆粒的親水相。

1.2.3 PEG反透析 對透過的物質(zhì)具有選擇性的薄膜稱為半透膜，可利用半透膜這一特性將樣本濃縮。①土壤樣本的處理：取10 g干燥土壤，加入200 mL 10 mmol/L 焦 磷 酸 鈉 、200 μL 5 mmol/L EDTA，在渦旋儀上劇烈渦旋20 min，4℃、11 000 ×g離心10 min，回收上清液；②污水的處理：用50目的過濾篩進(jìn)行簡單過濾，去除樣本中的大顆粒雜質(zhì)，加入NaCl（終濃度為1 mol/L）使水體中的噬菌體與帶電荷雜質(zhì)解離；③將①中的上清液或②處理后的水樣倒入半透膜中，扎緊袋口，做好標(biāo)記，置盒子中，并用PEG粉末將上述裝滿樣品的半透膜覆蓋，過夜反透析；④待半透膜中的液體滲透剩余1 mL左右時，反復(fù)用這1 mL液體洗滌半透膜，最后用移液器將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppendorf管內(nèi)。

1.2.4 超濾 將噬菌體液加入超濾管，4℃、11 000×g離心10 min，用SM緩沖液洗脫超濾管中的噬菌體，加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的細(xì)胞碎片，溫和振蕩30 s，4℃、3000 ×g離心15 min，回收含噬菌體顆粒的親水相。

1.3 噬菌體濾液效價的測定

噬菌體效價指噬菌體的滴度，即每毫升樣品含噬菌體的個數(shù)。通常是在含指示菌的平板上形成噬菌斑后進(jìn)行計數(shù)，以每毫升含有的噬菌斑形成單位（pfu/mL）表示其效價。將噬菌體濾液梯度稀釋9個滴度（10-1～10-9），取100 μL分別與200 μL指示菌一起加入半固體LB培養(yǎng)基中，鋪雙層平板，37℃培養(yǎng)過夜，按照平板中噬菌斑的個數(shù)計算噬菌體的效價。

2 結(jié)果

分別取IEM08、IEM11與T3噬菌體標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行梯度稀釋并滴板，經(jīng)計數(shù)確定T4（IEM08）、N4（IEM11）、T3的滴度分別為5×106、107和106pfu/mL，為確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)中噬菌體濃度的一致性，分別取200 μL N4、T4噬菌體上清液，700 μL T3噬菌體上清液，加到1 L空LB培養(yǎng)液中，混勻，使噬菌體的終濃度為103pfu/mL數(shù)量級。將所得的1 L噬菌體液分成200 mL的5等份，分別用PEG沉淀，PEG反透析，陰、陽離子結(jié)合樹脂，超濾對上述3種噬菌體進(jìn)行濃縮，并鋪雙層板計數(shù)，結(jié)果見表1、圖1。5種方法處理后比較噬菌體活性，超濾效果最好，其次是PEG反透析；PEG沉淀效果相對較差，樹脂的吸附?jīng)]有出現(xiàn)很好的濃縮效果。盡管5種方法對3種噬菌體的濃縮效果表現(xiàn)出相同的趨勢，但濃縮效果因噬菌體的不同而出現(xiàn)差異，PEG沉淀與反透析中T7表現(xiàn)出相對其他噬菌體較低的濃縮效果。綜合考慮濃縮效果、成本與時間等因素，我們將T4、N4、T7類噬菌體加到醫(yī)院的環(huán)境污水或河道淤泥中，然后利用PEG反透析進(jìn)行噬菌體的提取與活性測定，結(jié)果見表2、圖2，可以看到PEG反透析對淤泥與污水中噬菌體的濃縮效果較好，濃縮倍數(shù)達(dá)70倍。

表1 5種方法的濃縮結(jié)果原始數(shù)據(jù)

3 討論

圖1表明超濾效果最好，分析其原因，可能是超濾時可利用橫切力快速將大部分噬菌體截留，很少造成額外損失。但因超濾管處理樣品較少且濾膜易堵塞，故其使用有一定的局限性。雖然PEG反透析結(jié)果比超濾效果差一些，但仍可滿足試驗(yàn)對噬菌體活性的要求，故可彌補(bǔ)超濾處理樣品少的缺點(diǎn)，且其操作簡單，建議處理大量樣本時可考慮PEG反透析。PEG沉淀濃縮后的噬菌體活性相對較弱，原因可能是濃縮中高濃度PEG影響噬菌體活性，且在離心過程中會因未沉淀完全而丟失部分噬菌體。PEG反透析效果比超濾差，除了少量小分子PEG透過半透膜對噬菌體活性產(chǎn)生抑制外，還有可能是反透析耗時較長使活性丟失。如果濃縮只是單純?yōu)楂@得噬菌體的基因組而不考慮活性，PEG沉淀則不失為一種好的方法；若須獲得活性較高的高濃度噬菌體，則建議用PEG反透析或超濾或者兩者相結(jié)合，具體選擇哪一種則可根據(jù)處理的樣本量來決定。

表2 土壤、湖水樣本的反透析結(jié)果

圖2表明PEG反透析可很好地濃縮污水與淤泥中的噬菌體，能夠滿足大多數(shù)研究的濃縮要求。

理想的噬菌體濃縮方法必須滿足高效、簡便、快速等幾個條件，同時又可處理大體積水樣且能濃縮不同種類的噬菌體，不受樣本中有機(jī)質(zhì)和其他雜質(zhì)的影響，添加的絮凝劑和洗脫液不對后續(xù)檢測結(jié)果造成影響。上面介紹的5種濃縮方法各有優(yōu)劣，應(yīng)根據(jù)處理樣品和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇。

圖1 5種方法的濃縮結(jié)果

圖2 土壤、湖水樣本的反透析結(jié)果

[1]Levin B R,Bull J J.Phage therapy revisited:the population biology of a bacterial infection and its treatment with bacterio?phage and antibiotics[J].Am Nat,1996,147:881-898.

[2]Davies S J,Ogg C S,Cameron J S,et al.Staphylococcus au?reus nasal carriage,exit-site infection and catheter loss in pa?tientstreated with continuousambulatory peritonealdialysis(CAPD)[J].Periton Dialysis Int,1989,9(1):61-64.

[3]CapparelliR,Parlato M,Borriello G,etal.Experimental phage therapy against Staphylococcus aureus in mice[J].Anti?microb Agents Chemothery,2007,51(8):2765-2773.

[4]Wagenaar J A,Van Bergen M A P,Mueller M A,et al.PhagetherapyreducesCampylobacterjejunicolonization in broilers[J].Vet Microbiol,2005,109(3):275-283.

[5]Leverentz B,Conway W S,Camp M J,et al.Biocontrol of Listeria monocytogenes on fresh-cutproduce by treatment with lytic bacteriophages and a bacteriocin[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(8):4519-4526.

[6]Smith H W,Huggins M.Successful treatment of experimental Escherichia coli infections in mice using phage:its general su?periority overantibiotics[J].J Gen Microbiol,1982,128(2):307-318.

[7]Sambrook J,Russell D W.Molecular cloning:a laboratory manual[M].2nd ed.New York:CSHL press,2001.

[8]Clokie M,Kropinski A.Bacteriophages:methods and proto?cols,volume 1:isolation,characterization,and interactions[M].New York:Humana,2009.

[9]Jiang Huanhuan,Jiang Xiaofang,Wang Sheng,et al.The com?plete genome sequence ofa novelT4-like bacteriophage,IME08[J].Arch Virol,2011,156(8):1489-1492.