張昊，王福喜，武文杰，李茜，韓俊領(lǐng)

協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司，天津 300384

1989年10月，Gluckman首次將臍帶血用于治療一名兒童患者的全血細(xì)胞減少癥（范康尼貧血）。此后，臍帶血逐漸成為大家所接受的造血干細(xì)胞來(lái)源而用于醫(yī)療。全球現(xiàn)存的臍帶血資源相當(dāng)豐富，自體與公共標(biāo)本數(shù)達(dá)400 000份，而已用于臨床移植的就達(dá)20 000份之多，日本、澳大利亞和加拿大的臍帶血儲(chǔ)存與應(yīng)用都相當(dāng)發(fā)達(dá)。2000年以來(lái)，自體臍帶血儲(chǔ)存業(yè)務(wù)在我國(guó)蓬勃發(fā)展，北京，天津、上海等城市都成立了供自體儲(chǔ)存的臍血庫(kù)。臍帶血儲(chǔ)存事業(yè)蒸蒸日上，為臍帶血的應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，越來(lái)越多的關(guān)注也隨之而來(lái)[1-2]。

1 骨髓移植與臍帶血移植治療的比較

骨髓、臍帶血（UCB）和外周血是現(xiàn)今臨床移植所需造血干細(xì)胞的三大來(lái)源，其中骨髓在臨床移植中應(yīng)用最多，但約30%需要骨髓移植（BMT）的病人無(wú)法找到與之HLA配型相匹配的供者，所以臍帶血以其來(lái)源可靠且豐富、價(jià)格低廉、配型要求較BMT低等特點(diǎn)越來(lái)越受到關(guān)注。Eapen[3]比較了503例無(wú)關(guān)供者（UD）臍帶血移植（UD-UCBT）和282例全相合無(wú)關(guān)供者骨髓移植（UD-BMT），其中35例全相合臍血、201例1個(gè)位點(diǎn)不合臍血和282例2個(gè)位點(diǎn)不合臍血，在此基礎(chǔ)上又將細(xì)胞數(shù)以3×107/kg為界分為高、低細(xì)胞數(shù)2組。結(jié)果表明，與UD-BMT相比，HLA全相合及1個(gè)位點(diǎn)不合高細(xì)胞數(shù)UD-UCBT移植相關(guān)死亡率相似；UD-UCBT和全相合UD-BMT的原發(fā)病復(fù)發(fā)率相似，且2個(gè)位點(diǎn)不合UD-UCBT復(fù)發(fā)率低于全相合UD-BMT；進(jìn)一步比較了2個(gè)位點(diǎn)不相合UD-UCBT和全相合UD-BMT在6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)的復(fù)發(fā)率，UD-UCBT仍低于UD-BMT；HLA相合UD-BMT、UD-UCBT，1個(gè)位點(diǎn)不合的低細(xì)胞數(shù)UD-UCBT、1個(gè)位點(diǎn)不合的高細(xì)胞數(shù)UD-UCBT和2個(gè)位點(diǎn)不合的UCBT的5年EP分別是38%、60%、36%、45%和33%。因此，與全相合UD-BMT相比，1或2個(gè)位點(diǎn)不合的UD-UCBT的5年LFS與8/8相合的BMT相似，全相合UCBT的LFS高于全相合UDBMT。大量詢證醫(yī)學(xué)資料[4]表明臍血移植治療白血病作用更好，UCBT白血病復(fù)發(fā)率、無(wú)病生存率與長(zhǎng)期生存率與BMT/PBCT相當(dāng)，甚至更好。

臍帶血的應(yīng)用也有其要克服的困難。首先，每份臍帶血標(biāo)本的量有限，在治療成人患者時(shí)存在細(xì)胞劑量偏低的劣勢(shì)；其次，移植后患者的中性粒細(xì)胞和血小板中位時(shí)間明顯長(zhǎng)于骨髓移植，這也與臍帶血造血干細(xì)胞相對(duì)原始，需要的分化過(guò)程更多有關(guān)。針對(duì)這些制約因素，很多應(yīng)對(duì)及治療方法也在不斷發(fā)展之中。

2 異基因移植用臍帶血的選擇

在異基因臍帶血移植中，如何選擇供體標(biāo)本是首先面臨的問(wèn)題，HLA配型的相合程度和細(xì)胞劑量是要考慮的2個(gè)因素。供者與受者的HLA配型相合程度會(huì)直接決定植入成功與否，也會(huì)對(duì)移植物抗宿主病（GVHD）有不同程度的影響。在骨髓和外周血干細(xì)胞移植中需要高分HLA配型，而在臍帶血移植中一般只做HLA-A、-B、-DR位點(diǎn)的低分即可，這就大大增加了找到供者的可能。Delaney等研究發(fā)現(xiàn)，HLA-B位點(diǎn)的相合可縮短中性粒細(xì)胞和血小板的中位時(shí)間，而HLA-DR位點(diǎn)的相合可降低急性GVHD，高分結(jié)果與低分相比較對(duì)治療沒(méi)有影響[5]。因此，在考慮HLA相合時(shí)，在位點(diǎn)相合數(shù)相同的情況下，首先要考慮HLA-B和-DR位點(diǎn)的相合。

移植中輸注的CD34+細(xì)胞劑量與生存率及移植相關(guān)死亡率明顯相關(guān)，我們一般選擇的CD34+細(xì)胞劑量為1×105～1.5×105/kg，或有核細(xì)胞劑量2×107/kg，最低有核細(xì)胞劑量1×107/kg，而隨著配型相合度的降低，細(xì)胞劑量須相應(yīng)升高。4/6相合的臍帶血移植中細(xì)胞劑量要大于3×107/kg。表1給出了受配型相合度和細(xì)胞劑量所影響的臍帶血選擇優(yōu)先順序[6-7]。

3 臍帶血擴(kuò)增的臨床應(yīng)用

單份臍帶血所含有的造血干/祖細(xì)胞（HSPC）數(shù)相對(duì)少，不能滿足大體重兒童及成年人的需要。采用聯(lián)合細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)等方法，可在體外擴(kuò)增臍帶血HSPC，有望解決這一難題。其可能的機(jī)制在于外源性生長(zhǎng)因子能阻止細(xì)胞凋亡，刺激細(xì)胞增殖；基質(zhì)細(xì)胞能維持HSPC的自我更新能力，同時(shí)能促進(jìn)植入及調(diào)節(jié)免疫；灌注培養(yǎng)方式能維持穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物和移出代謝物，從而有利于細(xì)胞的擴(kuò)增。在擴(kuò)增細(xì)胞的同時(shí)應(yīng)盡量減少干細(xì)胞的分化，維持其長(zhǎng)期造血能力。

表1 移植用臍帶血選擇優(yōu)先原則

體外擴(kuò)增方法包括液體培養(yǎng)擴(kuò)增、基質(zhì)共培養(yǎng)擴(kuò)增、持續(xù)灌注擴(kuò)增。現(xiàn)有Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明，應(yīng)用體外擴(kuò)增的臍血細(xì)胞進(jìn)行移植是安全的，但未能像預(yù)期一樣加快植入速度；另外，由于缺乏特異性標(biāo)記，尚不能對(duì)擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行必要追蹤，因而還無(wú)法確定擴(kuò)增的臍血造血干/祖細(xì)胞在長(zhǎng)期造血重建中具體的作用機(jī)制。人臍血造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的起始培養(yǎng)細(xì)胞、維持HSPC自我更新和擴(kuò)增的最佳細(xì)胞因子組合及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑等也尚未明確[8]。

4 雙份臍帶血移植

在單份臍帶血不能滿足6/6或5/6位點(diǎn)相合，且在4/6相合情況下不能滿足＞3.5×107/kg的情況下，我們考慮采用雙份臍帶血移植的辦法。首先要選擇一份與受者相合位點(diǎn)最多且細(xì)胞劑量最大的臍帶血，另一份在滿足以上條件的基礎(chǔ)上，還要盡量與已選出的標(biāo)本HLA配型相合，且輸注的最小細(xì)胞劑量＞1.5×107/kg[9]。在移植過(guò)程中，2份標(biāo)本輸注的時(shí)間間隔一般為3～5 h，且間隔時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)移植效果沒(méi)有影響[10]。移植3個(gè)月后，通過(guò)DNA檢測(cè)可以觀察到造血是由1份標(biāo)本獨(dú)立完成的，我們假設(shè)在移植初期2份標(biāo)本在造血重建中都起作用，而一段時(shí)間后，另一份被慢慢排斥掉了[11]。

Eurocord等[12]比較了雙份UCBT（dUCBT）與單份UCBT（sUCBT）在緩解期急性白血病患者中的療效。在中性粒細(xì)胞恢復(fù)方面，兩者之間無(wú)明顯差異；然而，急性GVHD的發(fā)生率dUCBT高于sUCBT；2年非疾病復(fù)發(fā)相關(guān)死亡率兩者相似，但dUCBT的復(fù)發(fā)率低于sUCBT；2年無(wú)病生存率dUCBT高于sUCBT。多因素分析表明，dUCBT具有較高的急性GVHD發(fā)生率和較低的疾病復(fù)發(fā)率，在第一次完全緩解階段進(jìn)行UCBT，dUCBT具有較高的2年無(wú)病生存率。dUCBT患者的復(fù)發(fā)率低，提示dUCBT可能會(huì)獲得更強(qiáng)的移植物抗白血?。℅VL）效應(yīng)。

5 非親緣臍血與骨髓共輸注

在親緣HLA不全相合骨髓移植中，臍帶血的共輸注可以幫助解決移植相關(guān)性合并癥的問(wèn)題。北京道培醫(yī)院在2003年6月至2007年1月對(duì)29例親緣半相合骨髓移植患者進(jìn)行了臍帶血共輸注，與同期移植的29例未加臍血的患者比較，嚴(yán)重GVHD發(fā)生率在加臍血組顯著降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[13]。

臍血輔助移植后最終僅有一個(gè)移植物來(lái)源的細(xì)胞長(zhǎng)期植入。用變性高效液相色譜等技術(shù)結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列對(duì)8例接受HLA配型半相合的親緣造血干細(xì)胞與無(wú)血緣臍血混合移植后患者的嵌合狀態(tài)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)移植后14～60 d，8例混合移植患者的臍血均被排斥而逐漸轉(zhuǎn)為完全供者細(xì)胞嵌合狀態(tài)，表明作為第3方細(xì)胞源的UCB只在體內(nèi)短暫植入，最終會(huì)被排斥，只有植入潛能占優(yōu)勢(shì)的那一份移植物最終獲得持久植入[14]。

6 嵌合體的檢測(cè)

受體在接受異體或異種移植物后其體內(nèi)存在著供體細(xì)胞，而在移植物內(nèi)存在著受體細(xì)胞，這種供、受體細(xì)胞相互移行、相互存在的現(xiàn)象稱為嵌合現(xiàn)象。臍帶血移植后，受者的中性粒細(xì)胞和血小板的生長(zhǎng)滯后于骨髓或外周血干細(xì)胞的移植，這樣就延長(zhǎng)了我們判斷移植是否成功的時(shí)間，從而失去了挽救移植失敗的最佳時(shí)機(jī)。異基因的嵌合體一般在移植后14～18 d即可檢測(cè)出來(lái)，可能出現(xiàn)3種結(jié)果：①完全嵌合體：血液中受體細(xì)胞消失，完全由供體的血細(xì)胞取代，此時(shí)供者細(xì)胞占據(jù)受者的骨髓或外周血＞97%；②混合嵌合體：受體的血細(xì)胞是由供體和受體的骨髓共同提供的，供體細(xì)胞與受體細(xì)胞共存于受體，可同時(shí)檢測(cè)到供體與受體基因，供者細(xì)胞占2.5%～97%；③患者基因型：供體血細(xì)胞消失，此時(shí)只能檢測(cè)到患者的基因型，提示移植失敗[15]。

Moscardó等發(fā)現(xiàn)，清髓處理的71位患者在移植14 d后，嵌合體供者DNA含量在65%以上者，97%均實(shí)現(xiàn)了造血重建，而低于65%者只有2%實(shí)現(xiàn)了重建；同時(shí)，具有混合嵌合體患者的血小板植入也低于完全嵌合體患者[16]。臍帶血嵌合體的定量檢測(cè)對(duì)闡明植入機(jī)制、預(yù)測(cè)移植失敗和疾病復(fù)發(fā)有重要意義，能有效指導(dǎo)移植后免疫抑制劑的調(diào)整和及早的挽救治療，從而改善移植結(jié)果，提高患者的生存率。

7 結(jié)語(yǔ)

由于臍血來(lái)源廣泛及其自身特殊的免疫學(xué)特性，其作為新的造血干細(xì)胞移植的供源具有極大優(yōu)勢(shì)和潛力，我國(guó)成立的多家臍帶血庫(kù)對(duì)該資源的積累和保護(hù)意義重大。如今在臨床上采用最多的是臍帶血輔助半相合骨髓移植的治療，而臍帶血移植的重建治療相對(duì)較少，這主要是由其細(xì)胞數(shù)較低所造成的，但在體重較輕的兒科患者中，臍帶血細(xì)胞劑量的劣勢(shì)有所降低，體外擴(kuò)增與雙份臍血移植的不斷發(fā)展也為其應(yīng)用帶來(lái)了更廣闊的前景。

除造血重建之外，臍帶血細(xì)胞在皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)、腦神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)等方面同樣具有應(yīng)用前景。

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