盧艷敏

衡水學院 生命科學系，河北 衡水 053000

在進行基因治療及基因功能研究時，外源基因能否有效地導(dǎo)入受體細胞，并進行高效、穩(wěn)定的表達，在很大程度上取決于所采用的載體。理想的基因載體應(yīng)該制備簡單，重復(fù)性好，轉(zhuǎn)染效率高，具有良好的靶向性、較高的安全性，無免疫原性，能將目的基因整合至受體細胞的染色體上，實現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達。傳統(tǒng)的基因傳遞系統(tǒng)分為病毒載體介導(dǎo)系統(tǒng)和非病毒載體介導(dǎo)系統(tǒng)[1-2]。病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[3]、腺病毒載體[4]、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體[5-7]、單純皰疹病毒載體[8-9]。病毒載體是基因治療中較為常用的DNA運載工具[10]，其運載效率高達90%以上，但該系統(tǒng)具有免疫原性和病毒性，裝載容量有限，組裝難度大，花費高，因此限制了病毒載體的廣泛使用。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體[11]、陽離子多聚體[11-16]和納米顆粒[10,17-18]。磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNP）具有很強的結(jié)合、濃縮與保護DNA的作用，較高的安全性和低的免疫原性；具有超順磁性，在外加磁場的作用下可實現(xiàn)基因的靶向性運輸，提高外源基因的轉(zhuǎn)染效率。在磁性納米顆粒表面修飾生物材料，可以提高磁性納米顆粒的生物相容性。磁性納米顆粒有望在寄主范圍、基因裝載容量、轉(zhuǎn)染效率等方面克服現(xiàn)有基因載體的局限性，是一種極具應(yīng)用前景的非病毒載體。由于磁性納米顆粒的獨特性質(zhì)，使得其作為基因載體在基因治療中的應(yīng)用得到迅速發(fā)展。

1 磁性納米顆粒的特點、種類及結(jié)構(gòu)

磁性納米顆粒因其處于納米級，除了具有其他納米材料的特性外，還具有特殊的磁性能力即超順磁性。當具有磁性的顆粒小于某一臨界值時，外場產(chǎn)生的磁取向力太小而不足以抵抗熱騷動的干擾，導(dǎo)致其磁化性質(zhì)與順磁體相似，稱作超順磁性。當有外加磁場存在時，表現(xiàn)出較強的磁性，當撤去外加磁場時磁性隨之消失，不會產(chǎn)生剩磁。

磁性納米顆粒一般為核-殼式結(jié)構(gòu)，由磁性材料和提供活性功能基團的材料組成。磁性材料主要是納米級的鐵、鎳、鈷等金屬及其氧化物，其中應(yīng)用最多的是Fe3O4。提供活性功能基團的材料包括天然生物大分子材料和合成的高分子材料兩大類[19]，天然生物大分子材料主要有葡聚糖、淀粉、蛋白質(zhì)等；合成的高分子材料主要有聚乙二醇、聚乙烯醇、聚N-異丙基丙烯酰胺及其共聚物，要求其具有良好的生物兼容性，無毒性，并具備一定的機械強度和穩(wěn)定性。磁性納米顆粒一般有3種包裹方式：核-殼結(jié)構(gòu)，核為金屬氧化物，殼層為高分子材料；殼-核結(jié)構(gòu)，核為高分子材料，磁性納米材料包裹到外面；殼-核-殼結(jié)構(gòu)，外層和內(nèi)層均為高分子材料，磁性納米材料位于2層高分子材料中間。磁性納米顆粒的制備方法有多種，可分為物理法和化學法，主要有共沉淀法[20]、水熱法[21]、微乳液法[22]、溶膠-凝膠法[23]、模板法[24]等，每種方法各有優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)需求選擇適當?shù)姆椒ā?/p>

2 磁性納米基因載體的特點

作為基因載體的磁性納米顆粒是由含有磁性或可以被磁化的金屬如鐵、鈷、鎳及其金屬氧化物等材料制備而成的，通過共聚、表面改性等賦予其表面多種功能基團（如-OH、-COOH、-CHO、-NH2等），便于偶聯(lián)DNA等遺傳物質(zhì)形成磁性納米顆粒/DNA復(fù)合物，在外加磁場驅(qū)動作用下將攜帶基因的磁性納米顆粒定位富集于細胞表面或定向輸送到靶部位，增加了磁性納米顆粒/基因復(fù)合物與靶部位的接觸時間和接觸量，提高了基因載體的靶向性和基因轉(zhuǎn)染效率[25-26]。磁性納米顆粒介導(dǎo)的體外基因傳遞是將磁性納米顆粒/DNA復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)物內(nèi)，在細胞培養(yǎng)物的下面放置磁鐵，加速了攜帶基因的磁性納米顆粒的沉降，提高了轉(zhuǎn)染速度和效率[27]。磁性納米顆粒/基因復(fù)合物在外加磁場作用下首先吸附到細胞表面，隨后進入細胞，在轉(zhuǎn)染1～2 h后形成核周環(huán)復(fù)合物，其后數(shù)小時被轉(zhuǎn)運至核內(nèi)。Sauer等將磁性納米顆粒/基因復(fù)合物在細胞內(nèi)的運動分為3個時期：第一時期，復(fù)合物向細胞膜移動，隨后進入細胞，此過程為肌動蛋白細胞骨架介導(dǎo)的運動；第二時期，復(fù)合物被運送到細胞的限制組件中；第三時期，復(fù)合物通過微管被運送到細胞核內(nèi)[28]。磁性納米顆?？梢越閷?dǎo)體內(nèi)基因的傳遞，攜帶治療基因的磁性納米顆粒通過靜脈注射入體內(nèi)，將磁鐵置于靶部位，在外加磁場的作用下，磁性納米顆粒攜帶的基因通過血管進入靶組織，發(fā)揮治療功能[29]。

目前磁性納米顆粒中作為基因載體應(yīng)用較多的是氧化鐵磁性納米顆粒，磁性氧化鐵納米顆粒的制作工藝簡單，粒徑容易控制，具有比表面積效應(yīng)，易于結(jié)合DNA，具有超順磁性，在外加磁場的作用下具有較強的磁性，可以實現(xiàn)靶向性運輸，撤去磁場則磁性很快消失，不會被永久磁化。氧化鐵對細胞無毒，不易被酶消化降解，在磁性氧化鐵的表面可很容易地包埋生物高分子，使其具有很高的生物相容性，同時便于與外源基因結(jié)合。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化鐵納米顆粒在酸性條件下Zeta電位為正，可以與DNA結(jié)合；而在中性和堿性條件下Zeta電位為中性或負性，不利于DNA的結(jié)合，不能滿足生理pH條件下的基因轉(zhuǎn)移。因此，為了提高DNA的裝載量，使用帶正電荷的高分子材料對氧化鐵進行表面修飾[30]。唐秋莎等采用化學共沉淀法制備了磁性納米顆粒，然后用聚乙烯亞胺（PEI）對合成的納米顆粒進行表面修飾，發(fā)現(xiàn)PEI修飾的磁性納米粒子能與DNA結(jié)合，并可有效地保護DNA免受DNaseⅠ的消化[31]。譚澤明以偶聯(lián)劑Y-氨丙基三乙氧基硅烷［NH2C3H6Si（OC2H5）3］對合成的 Fe3O4磁性納米顆粒進行表面修飾，通過磁性納米顆粒與DNA的結(jié)合實驗，磁性納米顆粒/DNA復(fù)合物的DNaseⅠ和血清消化實驗結(jié)果表明Fe3O4磁性納米顆粒具有結(jié)合及保護DNA的能力，MTT實驗結(jié)果顯示其對細胞無明顯毒性[32]。Xiang等用多聚賴氨酸修飾氧化鐵納米顆粒，凝膠阻滯實驗和DNA共沉淀實驗表明修飾過的氧化鐵在生理pH條件下可與DNA結(jié)合，且隨著納米顆粒的增加，對DNA的結(jié)合力越來越強，并且氧化鐵納米顆粒與DNA的結(jié)合力可以保護DNA免受酶的降解，MTT實驗結(jié)果顯示多聚賴氨酸修飾的氧化鐵納米顆粒對細胞的毒性作用很小[30]。

磁性納米顆粒與DNA通過靜電作用吸引結(jié)合，這種非特異性相互作用使納米顆粒與DNA形成緊密的復(fù)合物，產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，阻止DNaseⅠ及Mg2+與DNA接觸，使DNaseⅠ不能發(fā)揮消化活性[33]，因此磁性納米顆粒具有很好的酶切保護效果。He等認為，由于納米顆粒的尺寸效應(yīng)使得DNA易于嵌入納米顆粒，導(dǎo)致結(jié)合在納米顆粒上的DNA構(gòu)象發(fā)生變異，這種結(jié)構(gòu)的改變使DNA免于被酶切[34]。

3 磁性納米基因載體研究進展

3.1 磁性納米顆粒作為載體在基因轉(zhuǎn)染中的研究

高效的基因輸送技術(shù)是將目的基因運送到宿主細胞，隨后目的基因在細胞中進行表達，發(fā)揮功能。目前有3種主要的基因輸送技術(shù)，即病毒載體、核酸電穿孔和核酸轉(zhuǎn)染，3種系統(tǒng)的效能見表1[27]。病毒載體雖然具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但可能會將病毒載體的基因插入宿主基因組，導(dǎo)致有害基因的表達。電穿孔也可將外源基因高效地轉(zhuǎn)運至宿主，但電刺激會導(dǎo)致50%的受體細胞死亡。通常使用的轉(zhuǎn)染試劑雖然對細胞的生長發(fā)育影響不大，但轉(zhuǎn)染效率不高影響了它們在臨床上的使用。磁性納米顆粒具有良好的結(jié)合與保護DNA的能力，作為基因載體可以高效轉(zhuǎn)運基因進入細胞，并且對細胞有很低的毒性，在醫(yī)學上具有很好的應(yīng)用前景。

Zhang等用PEI包裹的磁性納米顆粒作為載體連接小干擾RNA（siRNA）和含有綠色熒光蛋白（GFP）的質(zhì)粒，在外加磁場的作用下轉(zhuǎn)染3D細胞，siRNA的轉(zhuǎn)染效率為64%，GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為77%，使用短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒沉默GFP的表達，效率達到 82%[35]。Kievit等用 PEI、PEG 和 CS形成的共聚物包被氧化鐵納米顆粒，提高了納米顆粒的生物相容性，降低了細胞毒性，該納米顆粒能穩(wěn)定地結(jié)合、保護DNA，在外加磁場的作用下可以高效地將DNA轉(zhuǎn)運到腫瘤細胞和異種移植鼠模型的腫瘤中進行表達[36]。超支化聚乙烯亞胺（HPEI）修飾的磁性納米顆粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞，螢光素酶的表達水平比標準的PEI提高了13倍，并且對細胞的毒性作用也大大減小[37]。

自從1988年RNA干擾（RNAi）在線蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)后，使用RNAi解決人類疾病受到極大關(guān)注，許多科學家嘗試用RNAi技術(shù)來治愈mRNA水平的疾病。siRNA能識別并切割靶mRNA分子，從而導(dǎo)致目的基因不能表達。使用RNAi技術(shù)治療疾病的主要問題是如何將siRNA運送至靶細胞，提高它們在體內(nèi)的生物利用度，以及避免核酸酶的消化。為了克服這些難題，迫切需要強大的轉(zhuǎn)運載體[38]。實驗發(fā)現(xiàn)，聚合物包被磁性納米顆?？梢詳y帶siRNA等多種物質(zhì)進入靶器官，并且可以保護siRNA免受核酸酶的消化[39]。氧化鐵納米顆粒攜帶siRNA可以敲除小鼠腫瘤細胞內(nèi)GFP基因的表達[40]。與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，在納米顆粒表面修飾靶向性物質(zhì)可以提高治療效能，降低納米顆粒對細胞的毒性。通過這種提高的通透性和滯留效應(yīng)，大分子的治療物質(zhì)積累于腫瘤內(nèi)部。靶向性轉(zhuǎn)運方法包括細胞特異性靶向配體的使用，這種配體可以和細胞表面的受體結(jié)合。近年來的一些研究強調(diào)了這些靶向配體在提高運送效能方面的重要性[41-44]。研究證明，在納米顆粒表面連上一個特異性靶標肽，可以增加腫瘤對納米顆粒的吸收量及納米顆粒復(fù)合物的利用度，提高沉默效應(yīng)[45]。鐵轉(zhuǎn)運蛋白靶向的siRNA納米顆粒復(fù)合物顯著抑制了腫瘤的生長[44]，降低腫瘤螢光素酶的活性[46]。

表1 基因輸送系統(tǒng)

3.2 磁性納米顆粒與脂質(zhì)體、細胞穿膜肽結(jié)合在基因轉(zhuǎn)染中的研究

Yang等用脂質(zhì)體包被攜帶增強型GFP（EGFP）的四氧化三鐵磁性納米顆粒，轉(zhuǎn)染He99肺癌細胞，結(jié)果表明即使沒有磁場的作用，包被脂質(zhì)體的磁性納米顆粒轉(zhuǎn)染效率要高于脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率，在外加磁場的作用下轉(zhuǎn)染效率進一步提高[2]。細胞穿膜肽帶正電荷，能攜帶小分子、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)進入細胞，其穿膜能力不依賴于細胞的內(nèi)吞作用。Song等通過靜電作用將細胞穿膜肽Tat肽與磁性納米顆粒DNA結(jié)合，在外加磁場的作用下將此復(fù)合物轉(zhuǎn)染人體細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率比沒有Tat肽存在時提高了4倍；將該復(fù)合物通過腰椎注射入鼠脊髓，在動物背部從注射部位到腦部移動磁鐵，結(jié)果顯示，在外加磁場的作用下目的基因轉(zhuǎn)運至靶部位進行了表達，轉(zhuǎn)染效率比沒有Tat肽存在時提高了2倍[47]。

3.3 磁性納米顆粒與病毒載體結(jié)合在基因轉(zhuǎn)染中的研究

病毒載體的靶向性是體內(nèi)基因傳遞的一個主要難題，將病毒載體與磁性納米顆粒結(jié)合進行轉(zhuǎn)染，在外加磁場的作用下可以實現(xiàn)基因的靶向運輸，提高轉(zhuǎn)染效率。

Kamei等將腺病毒（adenovirus，Ad）基因轉(zhuǎn)運載體結(jié)合到金/氧化鐵磁性納米顆粒（GoldMAN）上形成Ad/GoldMAN復(fù)合物，用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細胞，在外加磁場作用下，與單獨使用Ad載體進行基因轉(zhuǎn)染相比，該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)使基因表達水平提高了1000倍，Ad/GoldMAN復(fù)合物直接進入細胞膜，不依賴于細胞表面的病毒受體和細胞的內(nèi)吞作用，這種機制有助于提高Ad載體的基因表達效率[48]。Hof?mann等將攜帶GFP基因的慢病毒載體與磁性納米顆粒結(jié)合，在外加磁場作用下轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞，GFP獲得高水平的表達，而在相同條件下沒有磁性納米顆粒的慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，熒光蛋白的表達水平很低；相同的情況發(fā)生在原代鼠上皮細胞、鼠成纖維細胞、豬皮膚成纖維細胞上。將慢病毒載體與磁性納米顆粒復(fù)合物注入鼠頸動脈后，在外加磁場的作用下可以改變慢病毒顆粒在機體組織內(nèi)的分布[49]。將溶瘤腺病毒與磁性納米顆粒結(jié)合，在外加磁場的引導(dǎo)下感染腫瘤多藥耐藥細胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外加磁場存在時細胞對有磁性病毒的吸收量與沒有磁性病毒相比增加了10倍，增強了病毒的溶瘤效應(yīng)。將溶瘤腺病毒/磁性納米顆粒復(fù)合物注射入小鼠移植瘤模型，在外加磁場作用下，具有磁性的腺病毒與單獨的腺病毒相比顯示了更強的溶瘤能力[50]。外源基因可以在Ad載體的介導(dǎo)下進入動物的腦，如果將Ad載體直接注入鼠胚胎腦室，Ad會均勻地感染腦室表面的神經(jīng)干細胞，而不能將目標基因轉(zhuǎn)運至鼠胚胎腦室靶部位。將生物素化的Ad載體與鏈霉素結(jié)合的磁性納米顆粒連接到一起，當Ad載體/磁性納米顆粒復(fù)合物被注入鼠胚胎腦室后，磁鐵被置于胚胎的頭部，病毒載體/磁性納米顆粒復(fù)合物將攜帶的外源基因運送腦的靶部位[51]。

4 結(jié)語

磁性納米顆?？梢詳y帶外源DNA進入細胞及動物機體，當磁性納米顆粒/DNA復(fù)合物進入細胞后，磁性納米顆粒與外源DNA如何解離，外源DNA如何進入細胞核進行表達并發(fā)揮功能，以及與外源DNA解離后的磁性納米顆粒從細胞中排出的途徑尚無定論，有待于進一步研究。

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