★ 王飛 黃佩蓓 曾賢 揭輝洋 余春波

(江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004)

白木通基因組DNA提取方法研究*

★ 王飛**黃佩蓓***曾賢 揭輝洋 余春波

(江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004)

以白木通新鮮葉片為材料，采用改良CTAB法提取DNA，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行了純度鑒定和PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：改良的CTAB提取法，能夠有效去除次生物質(zhì)對(duì)DNA的干擾，提高提取DNA的質(zhì)量和純度，適宜白木通葉片DNA的提取。該改良法提取的DNA可用于SRAP分析。

白木通；DNA提取

白木通(Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.var. Australis(Diels))為木通科木通屬落葉木質(zhì)藤本植物，是《中華人民共和國(guó)藥典》[1]收載的珍稀瀕危中藥材原植物。為了保證其可持續(xù)性利用，有必要進(jìn)行其種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，而獲取高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的基礎(chǔ)。[2]不同的植物由于體內(nèi)色素、酚類和多糖等次生物質(zhì)的含量不同，其所需要的DNA提取方法不同。[3]目前，提取植物基因組DNA的方法有CTAB法、SDS法、、高鹽低pH法、堿裂法、苯酚法、熱解法、試劑盒提取DNA的方法等。[4]CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)因可有效地去除樣品中的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，是植物中常用的DNA提取方法。本研究以白木通新鮮葉片為提取材料，采用改良CTAB法提取白木通基因組DNA，以期獲得高質(zhì)量的基因組DNA，為進(jìn)一步的白木通種質(zhì)資源遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

試驗(yàn)材料采自江西井岡山，經(jīng)賴學(xué)文教授鑒定，移植保存于江西中醫(yī)學(xué)院神農(nóng)園。

1.1.2 儀器與試劑

儀器：XPcycler-PCR(BIOER)、核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf)、JM-250電泳儀(Jim-X)、電泳槽(Jim-X)、H-1650高速離心機(jī)(xiang yi)、凝膠成像分析儀(Alpha Innotech)、HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋。試劑：CTAB(BBI)、PVP(BBI)，EDTA(BBI)、Tris(BBI)、Agarose(BBI)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

稱取白木通新鮮葉片0.1g于研缽中，加入適量PVP粉末，迅速倒入液氮研磨成干粉狀，然后將干粉轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，并加入預(yù)熱的2×CTAB提取液(2%CTAB，100mmoL/L Tris-Cl pH8.0，20 mmol/L EDTA pH8.0，1.4 mol/L NaCl, 2%β-巰基乙醇)750μL混合均勻，65℃水浴90min，每10min顛倒離心管1次，使沉淀充分溶解。取出離心管，冷卻至室溫。加入等體積酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)充分混勻，12 000 r/min離心5min。取上清液至干凈離心管中，吸取上清液，加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1)抽提2次。取上清到1.5 mL離心管，加入2倍體積的無水乙醇，4℃沉淀10min后，1 2000r/min，離心3min。棄上清，沉淀用70%酒精洗滌2-3次，室溫干燥1h后，用適量滅菌TE緩沖液溶解之，-20℃儲(chǔ)存或放入4℃冰箱待用。

1.2.2 DNA濃度檢測(cè)

DNA稀釋后于核酸蛋白測(cè)定儀上檢測(cè)濃度，體系為1μLDNA樣品加入99μL蒸餾水。DNA濃度、A260/A280直接從儀器上讀出，取3次數(shù)值的平均值。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

取2μLDNA樣品于0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。電壓80V，在染料到達(dá)膠面的2/3時(shí)取出，置于紫外透射儀中觀察，并拍照分析。

1.2.4 SRAP-PCR檢測(cè)

取白木通基因組DNA樣品2μL進(jìn)行SRAP-PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系如下：模板DNA100ng，前引物0.2μM，后引物0.2μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer2.5 mM， dNTPs(200μM)，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至總體積25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 2min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物10μL于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度與質(zhì)量

從表1可看出，采用改良CTAB法提取的白木通新鮮葉片基因組DNA質(zhì)量較好。DNA濃度在45-50 μg/mL之間，A260/A280在1.79～1.89之間，說明提取的DNA較純，蛋白、酚類等雜質(zhì)污染較少；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明DNA樣品的電泳譜帶明亮清晰、無拖尾，且點(diǎn)樣孔干凈，說明多糖、蛋白質(zhì)污染較少(見圖1)。

表1 白木通葉片提取的DNA濃度與A260/A280

圖1 改良CTAB法提取的白木通新鮮葉片DNA電泳圖

2.2 白木通DNA SRAP-PCR檢測(cè)

如圖2所示，樣品的SRAP-PCR分析結(jié)果顯示，改良CTAB法提取的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，多態(tài)性好。由此可見，改良CTAB法提取的DNA適于進(jìn)行樣品SRAP分析。

3 討論

白木通葉片含有較多的酚類和多糖等次生代謝物質(zhì)，特別是老葉，提取基因組DNA常常出現(xiàn)褐化、沉淀呈膠狀現(xiàn)象。本法采用改良2×CTAB法,新鮮葉片不剪碎加入適量PVP粉末和液氮一起研磨，同時(shí)β-巰基乙醇的用量加大至2%；另外，在充分研磨的基礎(chǔ)上，還將水浴鍋保溫時(shí)間延長(zhǎng)至90min。通過改良有效地去除了酚類、多糖物質(zhì)，獲得了高質(zhì)量的白木通基因組DNA，研究結(jié)果表明，該改良法提取的DNA適于SRAP研究，且該法使用普通離心機(jī)抽提DNA，方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005：43．

[2]李金璐，王碩，于婧，等．一種改良的植物DNA提取方法[J].植物學(xué)報(bào)，2013，48(1)：72-78．

[3]申丹，曾杰，周世良，等．4種石山植物DNA提取方法篩選[J].廣西科學(xué)，2005，12(4)：340-342．

[4]王關(guān)林，方宏筠．植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：533-535．

MethodforExtractingGenomicDNAfromLeavesofAkebiaTrifoliata(Thunb.)Koidz.var.Australis(Diels)*

WANGFei**,HUANGPei-bei***,ZENGXian,JIEHui-yang,YUChun-bo

JiangxiUniversityoftraditionalChineseMedicine,JiangxiNanchang330004

With fresh leaves ofAkebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.var. Australis(Diels)as materials, the modified CTAB method is adopted to extract DNA. The purity test and the PCR test were conducted to the DNA. The results showed that it can effectively eliminate the interfere of secondary substances to DNA and improve quality and purity of extracted DNA when CATB method was modified. The modified CTAB method is suitable for extracting DNA from fresh leaves ofAkebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.var. Australis(Diels), and the extracted DNA can be used in SRAP analysis．

AkebiaTrifoliata(Thunb.)Koidz.var. Australis(Diels)；DNA Extraction；

江西中醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：JZYC12C01),江西中醫(yī)學(xué)院2012年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：201210412024)。

**作者簡(jiǎn)介：王飛(1988-),女,浙江杭州人,在讀碩士研究生,主要從事中藥分子生物學(xué)研究,E-mail:Lv.19.88@163.com。

***通訊作者：黃佩蓓(1964-),女,浙江江山人,教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要從事中藥生化研究,E-mail:hhhpei@tom.com。

S641.3

A

2013-11-07)