★ 彭曉杰 黃玉輝 吳小川 鄭衛(wèi)民 傅睿 李群 苗靜 齊海峰

(1.江西省兒童醫(yī)院 南昌 330006；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 長(zhǎng)沙 410008)

黃芪對(duì)IgA腎病大鼠腎組織α-SMA和FN的影響

★ 彭曉杰1*黃玉輝1**吳小川2鄭衛(wèi)民1傅睿1李群1苗靜1齊海峰1

(1.江西省兒童醫(yī)院 南昌 330006；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 長(zhǎng)沙 410008)

目的:探討黃芪對(duì)IgA腎病大鼠腎組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)表達(dá)的影響，以觀察黃芪對(duì)對(duì)IgA腎病的治療作用及抗腎間質(zhì)纖維化的機(jī)理。方法：復(fù)制IgA腎病大鼠模型，并給予黃芪治療，分析腎臟病理改變，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)各組大鼠腎組織中α-SMA、FN的表達(dá)情況。結(jié)果：IgA腎病模型組大鼠腎小球系膜區(qū)、腎小管、腎間質(zhì)病理?yè)p害較正常對(duì)照組和黃芪治療組明顯加重，模型組大鼠腎小球系膜區(qū)IgA免疫熒光明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組(P<0.001)和黃芪治療組(P<0.001)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常組腎組織有少量α-SMA和FN的表達(dá)，而IgA腎病模型組大鼠腎組織中α-SMA和FN表達(dá)明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組和黃芪治療組α-SMA(P<0.05)和FN(P<0.05)比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：黃芪可以抑制IgA腎病大鼠腎組織中α-SMA和FN的表達(dá)，從而干預(yù)腎間質(zhì)纖維化，減輕腎臟病理改變，延緩IgA腎病的發(fā)生發(fā)展。

黃芪；IgA腎??；大鼠；α-SMA；FN

IgA腎病發(fā)病機(jī)制尚不明，故目前無(wú)治療的重大進(jìn)展。西藥對(duì)本病目前尚無(wú)特殊有效的治療方法和措施。黃芪是中醫(yī)傳統(tǒng)補(bǔ)氣藥，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，許多研究顯示，其在治療腎病綜合癥、蛋白尿、慢性腎炎等方面有顯著療效。本研究觀察黃芪對(duì)IgA腎病大鼠腎組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)改變的情況，明確黃芪對(duì)腎臟的作用和機(jī)制，為臨床上緩解IgA腎病的發(fā)生發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年SD純種大鼠32只，雌性，體重(150±15)g，全部購(gòu)自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)為SYXK(湘)-2008-0013，動(dòng)物飼養(yǎng)室符合二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前3d，均做尿蛋白、尿潛血(試紙法)檢查，以排除非健康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組8只，模型組和黃芪治療組各12只。

1.2 造模用藥

牛血清白蛋白(北京夏斯生物技術(shù)有限公司)、脂多糖(SIGMA公司)、四氯化碳、蓖麻油。

1.3 主要試劑

好好黃芪顆粒(四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司)、小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體(美國(guó)R&D公司)、小鼠抗大鼠FN單克隆抗體(美國(guó)R&D公司)、羊抗大鼠IgA單克隆抗體(Southern生物技術(shù)公司)、抗小鼠二抗試劑盒(北京中杉)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

模型組大鼠予隔日口服牛血清白蛋白(400mg/kg)，皮下注射四氯化碳(蓖麻油0.5mL+CCl4 0.10mL, 每周1次，持續(xù)9周)并加用脂多糖(LPS)(第6、8周予0.05mg)尾靜脈注射[1]然后觀察至第12周末。黃芪治療組造模方法同模型組，第8周開始口服黃芪顆粒劑，劑量為成人每日每kg體重10倍量，直到12周末?？瞻讓?duì)照組只隔日口服和靜脈注射生理鹽水，直到12周末。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

觀察實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織病理變化(HE染色、PAS染色、IgA免疫熒光)，并用免疫組化檢測(cè)腎組織α-SMA和FN的表達(dá)量。采用多功能真彩色病理分析系統(tǒng)(由北京航空航天大學(xué)圖像中心提供)進(jìn)行免疫組化分析：計(jì)算每張切片10個(gè)200倍視野下染色區(qū)域面積占整個(gè)腎組織面積的百分比，以均值表示表示每例腎組織陽(yáng)性面積信號(hào)。IgA免疫熒光參考目前國(guó)內(nèi)外通用的5級(jí)法分級(jí)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

除正常組外，各實(shí)驗(yàn)組大鼠于造模時(shí)均有不同程度的食欲減少，精神萎靡，注射脂多糖后第二天情況加重。部分大鼠出現(xiàn)皮毛蓬亂，或出現(xiàn)腹瀉，于8-10d自行緩解。模型組死亡3只，黃芪治療組死亡2只，均已從實(shí)驗(yàn)中剔除。

2.2 腎組織IgA熒光強(qiáng)度變化

正常組大鼠腎小球系膜區(qū)無(wú)IgA沉積，模型組腎小球系膜區(qū)有較強(qiáng)的團(tuán)塊狀黃綠色強(qiáng)IgA熒光或顆粒狀中等強(qiáng)度IgA熒光，兩者相比較有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，表明IgA腎病模型復(fù)制成功。黃芪治療組大鼠腎小球系膜區(qū)IgA熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.001)，表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)內(nèi)散在的線狀或顆粒狀的IgA輕度沉積(見圖1)。提示黃芪可以降低實(shí)驗(yàn)IgA腎病大鼠腎組織IgA熒光強(qiáng)度(見表1)。

表1 各組大鼠腎組織IgA強(qiáng)度的比較

2.3 臨床指標(biāo)及腎臟病理的變化

研究提示黃芪有降低實(shí)驗(yàn)IgA腎病大鼠尿紅細(xì)胞和尿蛋白水平，且可抑制IgA腎病大鼠腎臟系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)的增生(見圖1)。

2.4 腎組織α-SMA和FN變化

免疫組化結(jié)果顯示：α-SMA正常少量表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞的胞漿和胞膜，另少量表達(dá)于腎小球及腎間質(zhì)，F(xiàn)N少量表達(dá)于腎近曲、遠(yuǎn)曲間質(zhì)內(nèi)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)表達(dá)。與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織內(nèi)α-SMA和(P<0.01)和FN(P<0.05)表達(dá)明顯增強(qiáng)，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。黃芪治療組與正常組比較腎臟組織內(nèi)α-SMA和FN表達(dá)輕度增強(qiáng)，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示黃芪可以明顯降低IgA腎病大鼠腎組織內(nèi)α-SMA和FN的表達(dá)。

表2 各組大鼠腎組織α-SMA和FN表達(dá)面積比較

A為正常組；B為模型組；C為治療組

3 討論

兒童IgA腎病是兒童常見的原發(fā)性腎小球疾病之一，約有20%-30%的患兒在起病20-30年后發(fā)展為慢性腎功能衰竭。[2]但由于IgA腎病發(fā)病機(jī)制不明，故目前尚無(wú)治療的重大進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)采用隔日口服大劑量的牛血清白蛋白，皮下注射四氯化碳加尾靜脈注射脂多糖復(fù)合方法塑造IgA腎病模型，免疫熒光示IgA在腎小球系膜區(qū)呈彌散性顆粒狀或線狀沉積，腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生，符合IgA腎病的病理變化，表明實(shí)驗(yàn)性IgA腎病大鼠模型復(fù)制成功。

IgA腎病腎小管-間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)理之一是腎小管上皮轉(zhuǎn)分化為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞、游離腎小管而致腎小管萎縮。[3]研究發(fā)現(xiàn)，[4]腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后均表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白-α-SMA，異化為肌成纖維細(xì)胞(MF)，MF具有比成纖維細(xì)胞更強(qiáng)大的增殖、分泌能力，其分裂增生及分泌能力增強(qiáng)，合成大量細(xì)胞外基質(zhì)成分如纖維連接蛋白(FN)、I、III、IV型膠原(Col l、III、IV)、層粘連蛋白(LN)，沉積于腎間質(zhì)，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。[5]α-SMA的表達(dá)可以反映肌成纖維細(xì)胞的變化。FN可精確反應(yīng)腎臟纖維化程度，兩者的表達(dá)變化在一定程度上反應(yīng)腎功能損害程度與所用藥物存在的相關(guān)性。[6]正常情況下，F(xiàn)N在腎臟表達(dá)不明顯，在腎間質(zhì)病變時(shí)表達(dá)增強(qiáng)。[7]我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IgA腎病大鼠腎組織α-SMA、FN的表達(dá)明顯升高，α-SMA主要表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞的胞漿和胞膜，另少量表達(dá)于腎小球及腎間質(zhì)，F(xiàn)N主要表達(dá)于腎近曲、遠(yuǎn)曲間質(zhì)內(nèi)；表明α-SMA、FN參與了IgA腎病的發(fā)病過程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)黃芪治療組α-SMA及FN表達(dá)較模型組明顯減弱，表明黃芪可以明顯抑制IgA腎病大鼠腎組織中α-SMA、FN的表達(dá)，提示黃芪在治療IgA腎病時(shí)可通過減少腎組織中α-SMA、FN的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成，來(lái)延緩IgA腎病的硬化。腎臟病理亦證實(shí)，黃芪治療組系膜基質(zhì)、系膜細(xì)胞和系膜區(qū)IgA沉積明顯減少。

本實(shí)驗(yàn)表明黃芪可以抑制IgA腎病大鼠腎組織中α-SMA和FN的表達(dá)，從而干預(yù)腎間質(zhì)纖維化，減輕腎臟病理改變，延緩IgA腎病的發(fā)生發(fā)展。黃芪是否還有其他機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

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TheInfluenceofAstragalusonα-SMAandFNinratwithIgANephropathy

PENGXiao-jie1*,HUANGYu-hui1**,WUXiao-chuan2,ZHENGWei-min1,FURui1,LIQun1,MIAOJing1,QIHai-feng1

1.JiangxiChildren'shospital,Nanchang330006;2.XiangyaNo.2hospitalofZhongnanUniversity,Changsha410008

Objective:To study the influence of Astragalus on α-SMA and FN in rat with IgA nephropathy so as to observe the mechanism of the astragalus in its therapy function and its resistance mechanism of renal interstitial fibrosis. Methods: Rat IgA nephropathy (IgA N) model was established. The rats was treated with astragalus. Albuminuria ,haematuria and pathological chang of renal tissue were measured. The distribution of α-SMA and FN in renal tissue was detected in rat IgA nephropathy model by immunohistochemical staining. Results: The pathological change of glomerular mesangium, nephric tubule and renal interstitial became serious in rat IgA nephropathy model, when compared with normal control group and astragalus treatment group. Immumofluorescence showed renal IgA density in rat IgA nephropathy model make a contrast to the normal control group(P<0.001) and astragalus treatment group(P<0.001). The result of histochemistry showed that the distribution of α-SMA and FN in normal renal tissue was small. The distribution of α-SMA and FN in IgA nephropathy model dramatically potentialized in normal control group (P<0.05)and astragalus treatment group(P<0.05). Conclusion: Astragalus can prevent the express of α-SMA and FN of rat with IgA nephropathy, in addition it can interfere with the interstitial fibrosis of kidney and pathological changes to delay the development and progression of IgA nephropathy.

Astragalus；IgA nephropathy；Rat；α-SMA；FN

彭曉杰，男，主治醫(yī)師，E-mail:wuxuan1028@163.com。

**通訊作者：黃玉輝，男，副主任醫(yī)師，E-mail:hyh691212@163com。

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2013-10-12)