孟 芳 張卿 蔡婧怡 禹思宇 趙和平 朱忠武 唐連飛

(湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局 湖南長沙 410004)

1 前言

熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是分子生物學(xué)中廣泛運(yùn)用的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)施在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對參照物進(jìn)行分析，計(jì)算檢測樣品模板的初始濃度。目前這項(xiàng)技術(shù)越來越多地運(yùn)用到食品檢測之中，例如，用熒光定量PCR技術(shù)來檢測食品中的轉(zhuǎn)基因成分［1］和微生物成分等［2］，其中部分熒光定量PCR檢測方法已經(jīng)作為標(biāo)準(zhǔn)推廣于社會(huì)。但是熒光定量PCR技術(shù)在食品檢測的運(yùn)用過程中也受到一些限制，主要是因?yàn)楦鞣N食品經(jīng)過不同程度的深度加工，其中所含有的DNA成分遭到不同程度的破壞，并且在生產(chǎn)過程中，混入不同的添加劑和佐料，使食品的成分更加復(fù)雜［3，4］。如何提取出高質(zhì)量的DNA成為熒光定量PCR應(yīng)用于食品檢測的一個(gè)限制因素。

據(jù)營養(yǎng)學(xué)專家介紹，羊奶在國際營養(yǎng)學(xué)界被稱為“奶中之王”，羊奶的脂肪顆粒體積為牛奶的三分之一，更利于人體吸收，并且長期飲用不會(huì)引起發(fā)胖。羊奶中的維生素及微量元素明顯高于牛奶，美國、歐洲的部分國家均把羊奶視為營養(yǎng)佳品，歐洲鮮羊奶的售價(jià)是牛奶的7倍。但是現(xiàn)在市面上羊奶原料緊張，部分商販以牛奶摻入羊奶中以降低制造成本。本方法無需進(jìn)行DNA提取，奶粉經(jīng)核酸釋放劑處理后可直接進(jìn)行熒光定量PCR檢測，并采用熒光定量PCR方法來鑒別牛、羊奶粉。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品與試劑

不同品牌牛、羊奶粉:均從超市購買;苯酚、氯仿、異戊醇等試劑:均為分析純;核酸定量檢測試劑盒(PCR－熒光探針法):由圣湘生物提供。

2.1.2 儀器

熒光定量PCR擴(kuò)增儀LC480:羅氏公司;臺(tái)式高速離心機(jī)Mikro200:HETTICH公司;微量分光光度計(jì)Nannodrop1000:Thermo公司。

2.2 方法

2.2.1 定量PCR反應(yīng)體系

取10mg奶粉樣品于2ml的Eppordorf管中，加100μL蒸餾水溶解奶粉，取10μL溶解后的液態(tài)奶，再加入10μL核酸釋放劑，吹打混勻5次，等待10min。

按下列組分配制PCR反應(yīng)液:PCR反應(yīng)液16μL;熱啟動(dòng)酶1μL;兩套引物和探針同時(shí)加入，上下游引物各1μL;探針溶液1μL;經(jīng)核酸釋放劑處理過的樣本5μL。

2.2.2 定量PCR反應(yīng)條件

依據(jù)同源性分析結(jié)果，最終選擇牛羊線粒體DNA的12SrRNA種內(nèi)保守種間特異的區(qū)域作為牛羊特異檢測的靶序列。依據(jù)靶序列，用Primers軟件設(shè)計(jì)檢測牛源成分的實(shí)時(shí)定量引物和探針及檢測羊源成分實(shí)時(shí)定量引物和探針。牛源性探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅基團(tuán)，羊源性探針5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅基團(tuán)。引物和探針由大連寶生物公司合成。引物探針序列及各種參數(shù)［10］見表1。反應(yīng)條件:95℃ 10sec;95℃ 5sec，60℃30sec 40個(gè)循環(huán)。

表1 引物及探針序列

3 結(jié)果與分析

3.1 定量PCR鑒別牛羊奶粉方法的建立

在同一反應(yīng)管內(nèi)對牛、羊的12SrRNA同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用多色熒光檢測技術(shù)，對反應(yīng)液中含有的兩種不同熒光進(jìn)行兩通道同步檢測，實(shí)現(xiàn)多色熒光同步檢測。結(jié)果見下表2、圖1、圖2。結(jié)果表明羊奶粉中無牛奶成分，牛奶粉中也無羊奶成分。檢測過程中僅需奶粉5mg，表明該方法所需樣本少、無需進(jìn)行DNA提取，操作過程簡單省時(shí)。

表2 牛、羊奶粉熒光值及結(jié)果判定

圖1 羊奶粉中牛源性成分鑒定結(jié)果

圖2 牛奶粉中羊源性成分鑒定成果

3.2 定量PCR鑒別牛羊奶粉方法的應(yīng)用

對從超市購買的6種不同品牌的羊奶粉進(jìn)行鑒別檢測。結(jié)果顯示(圖3)FAM通道除陽性對照外，6個(gè)羊奶粉樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表明這6個(gè)羊奶粉中沒有摻入牛奶成分。另外6個(gè)羊奶粉HEX通道均出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線(圖4)，表明其確為羊奶粉。

表3 6種品牌羊奶粉熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 6種品牌羊奶粉中牛源性成分的鑒定結(jié)果

圖4 6種品牌羊奶粉中羊源性成分的鑒定

3.3 羊奶粉中熒光PCR檢測牛奶粉的敏感性分析

分別稱取1g羊奶粉和牛奶粉，加入10mL去離子水溶解。同時(shí)，將牛奶以不同的比例摻入純牛奶中，提取DNA并進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)牛奶以 0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20% 的比例(體積)摻入至羊奶中時(shí)，均能通過熒光PCR得到擴(kuò)增(如圖5)，且牛奶含量越高CT值越小，表明本法敏感性高。

圖5 檢測含不同比例牛奶的羊奶的熒光PCR結(jié)果

4 討論

奶食品有牛奶、馬奶、山羊奶等。在歐美國家羊奶被視為乳品中精品，稱作“貴族奶”，國際學(xué)界譽(yù)為“奶中之王”。羊奶因其營養(yǎng)價(jià)值更優(yōu)于牛奶，市場售價(jià)高于奶牛，加上現(xiàn)在市面上羊奶原料緊張，部分商販以牛奶摻入羊奶中以降低制造成本，這嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。

目前沒有對羊奶粉成分摻假檢測方法的報(bào)道，僅有個(gè)別對于牛奶成分摻假檢測方法的報(bào)道:吳茹怡［5］采用化學(xué)方法檢測牛奶中的豆質(zhì)成分和大米淀粉成分等，但是該方法過于表觀，且靈敏度不夠;皮付偉等［6］采用近紅外的分析方法來檢測牛奶的成分，但是對牛奶中的羊源性成分檢測不能判斷。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR方法鑒別奶粉中的牛、羊源性成分，可鑒別羊奶粉的真假。實(shí)驗(yàn)證明，該方法操作簡單可行，能檢測到羊奶中摻入的牛奶成分低至0.1%，靈敏度高。

之前的研究中運(yùn)用以DNA為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法檢測奶粉中牛羊源性成分的關(guān)鍵在于DNA提取的成功與否。由于不同的奶粉具有各不相同的功能，因此其成分及加工工藝也都各不相同，各個(gè)品種之間的差異性很大，在提取DNA時(shí)要充分考慮到各類成分對DNA提取數(shù)量和質(zhì)量的影響，同時(shí)也要考慮到加工工藝對 DNA的降解影響［7］。田雨［8］曾從牛乳中的白細(xì)胞中提取牛奶的DNA，但是，該方法需要的樣品多，提取得到的DNA不僅濃度低，且蛋白含量過高。覃芳芳［9］將酚仿抽提DNA的方法和前處理相結(jié)合得到了一種快速簡便的從牛奶中提取DNA的方法，但該方法更適用于牛奶中植物成分DNA的提取。以上方法都需要經(jīng)過DNA提取的過程，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且DNA質(zhì)量和純度并不高，本實(shí)驗(yàn)不需要經(jīng)過DNA的提取過程，微量樣本經(jīng)核酸釋放劑裂解后直接可以進(jìn)行熒光定量PCR檢測。該方法快速簡便，且靈敏度高。另外，該方法全過程僅需1.5h左右，與其他方法相比更快速更適用于推廣。本實(shí)驗(yàn)建立起來的牛羊奶粉的鑒定方法快速、靈敏，可利用該方法來鑒別奶粉，打假治劣、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。

［1］蔡慧農(nóng)，劉光明，蘇文金，等.TaqMan探針用于轉(zhuǎn)基因食品的熒光定量 PCR檢測［J］.食品與發(fā)酵工程，2008，29(12):1－6.

［2］馬兆飛，李潔莉，胡紅琴，等.PCR和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)快速檢測牛奶樣品中的沙門氏茵［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2008，8(5):132－137.

［3］邵碧英，張?bào)w銀，楊婕，等.動(dòng)物產(chǎn)品及飼料中牛源和羊源性成分PCR檢測方法的優(yōu)化［J］.中國獸醫(yī)科技，2005，35(3):225－229.

［4］陳沁，徐仙，姚麗萍.牛奶摻豆?jié){和奶粉的PCR檢測［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010，5.162 －165.

［5］吳茹怡.牛奶摻假物檢驗(yàn)方法研究［J］.大眾科技，2005(9):91－92.

［6］皮付偉，王燕嶺，魯超，等.CCD短波近紅外光譜儀測定牛奶成分的可行性研究［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2006(4):34，36.

［7］邵碧英，楊婕，張?bào)w銀.動(dòng)物產(chǎn)品的DNA提取方法［J］.畜牧與獸醫(yī)，2005，37(9):47 －49.

［8］田雨.從牛奶中分離DNA方法的建立［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2006，3:112 －113.

［9］覃芳芳，鄧鴻鈴，郭新東，等.牛奶中植物成分的PCR檢測方法研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(6):234－236.

［10］鄭文文.飼料中牛羊源成分熒光定量PCR檢測方法的建立［D］.吉林:吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009，6:13.