徐小勇，王 玉，孫 禾，張鵬鵬，施 毅

煙曲霉（Aspergillusfumigatus）是自然界中廣泛存在的腐生微生物，也是一種非常重要的條件致病真菌。煙曲霉感染特別是侵襲性肺曲霉病預(yù)后差，即使正確的抗真菌治療后，病死率仍高達(dá)50%［1］。目前，對(duì)于煙曲霉具體致病機(jī)制仍知之甚少［2－3］。肺泡上皮細(xì)胞是侵襲性肺曲霉病致病的第一站，曲霉孢子是借助何種侵襲因子與上皮細(xì)胞接觸進(jìn)而侵入宿主細(xì)胞目前仍未明確［4］。

病原體侵入宿主細(xì)胞的機(jī)制在產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、白念珠菌等侵入上皮細(xì)胞過程中有充分的研究［5－9］。李斯特菌侵襲因子internalin A（Inl A）的胞外段以15個(gè)β－sheet形成半圓型結(jié)構(gòu)可以和上皮細(xì)胞黏附子E－cadherin的胞外結(jié)構(gòu)EC1結(jié)合，從而介導(dǎo)了李斯特菌黏附侵入上皮細(xì)胞。先前的研究表明，cadherin參與了煙曲霉黏附侵襲宿主細(xì)胞的過程，即煙曲霉中存在可以和人E－cadherin結(jié)合的蛋白序列［10－11］。本研究擬通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)煙曲霉中與cadherin結(jié)合的侵襲因子進(jìn)行初步探討。

材料與方法

一、煙曲霉中InlA相似序列的搜索

在PubMed上搜索李斯特菌的InlA氨基酸序列，記錄其中參與結(jié)合E－cadherin的功能域富亮氨酸重復(fù)序列（leucine－rich repeats，LRRs），以此序列在煙曲霉基因組（Af293）查詢相似序列（BLASTp）［12］。ExPASy Proteomics Server的Compute pI／Mw tool計(jì)算相關(guān)序列的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)，分析一級(jí)結(jié)構(gòu)。

二、相似序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

應(yīng)用EXPASY（www.expasy.org／tools）上的PredictProtein（PHD，多重比對(duì)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)比對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)法）分析預(yù)測(cè)相似序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

三、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)同源性大于30%的蛋白上傳至SWISSMODEL服務(wù)器開展模型構(gòu)建工作，其他同源性不足的蛋白選擇Phyre（Successor of 3D－PSSM），用swiss－pdb viewer分析觀察模擬的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

四、免疫共沉淀

煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)株（AF293）由我院微生物室提供，生長(zhǎng)于沙保弱培養(yǎng)基后5 d，滅菌磷酸緩沖液（PBS）沖洗獲取培養(yǎng)基表面的孢子，用16層紗布過濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用無血清DMEM培養(yǎng)液（Gibco）稀釋到107個(gè)／mL，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。純化的人E－cadherin蛋白購(gòu)自北京義楚神州生物技術(shù)公司（100μg）。離心沉淀煙曲霉孢子，充分裂解，加入純化E－cadherin 50μg，常規(guī)方法行免疫共沉淀，電泳分析其相對(duì)分子質(zhì)量。

結(jié)果

一、Inl A中LRR的氨基酸序列

LRR的氨基酸序列為：IDGLEYLNNLTQINFSNNQLTDITPLKULTKLVDILMNNNQIADITPLANSSNLTGLTLFNNQITDIDPLKNLTNLNRLELSSNTISDISALSGLTSLQQLSFGNQVTDLKPLANLTTLERLDISSNKVSDISVLAKLTNLESLIATNNQISDITPLGILTNLDELSLNGNQLKUIG。

以此序列在煙曲霉AF293中搜索相似序列，見表1。結(jié)合對(duì)相似序列的描述，選擇XP750927.1、XP750245.1、XP752100.1、XP748256.1進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

相似序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，見表2。

表1 曲霉基因組中的Inl A同源序列Table 1 Homologous sequences with InlA in Aspergillus fumigatus genome

表2 相似蛋白的基本信息Table 2 Basic information of relevant proteins

二、相似序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

（一）XP750245.1的二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白的H螺旋結(jié)構(gòu)占30.14%，β折疊占4.84%，無規(guī)則卷曲占65.02%。無穿膜序列及核定位序列。

（二）XP750927.1的二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白的H螺旋結(jié)構(gòu)占9.63%，β折疊占7.98%，無規(guī)則卷曲占82.39%。無穿膜序列及核定位序列。

（三）XP752100.1的二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白的H螺旋結(jié)構(gòu)占25%，β折疊占6.53%，無規(guī)則卷曲占68.47%。無穿膜序列及核定位序列。

（四）XP748256.1的二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白的H螺旋結(jié)構(gòu)占40.98%，β折疊占17.32%，無規(guī)則卷曲占41.71%。預(yù)測(cè)7個(gè)穿膜序列，最高評(píng)分為0.893 1，為第239－257氨基酸殘基。最高Zscore＝1.287。無核定位序列。

（五）三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 通過將上述4蛋白的序列提交給SWISS－MODEL（同源重建）和Phyre服務(wù)器。XP750927.1和XP750245.1同源性較好采用swiss－model的同源重建，其余提交Phyre服務(wù)器，獲得三維結(jié)構(gòu)，見圖1。提示XP752100.1、XP748256.1與InlA三維結(jié)構(gòu)類似。

圖1 煙曲霉中與InlA相似蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖Figure 1 The diagram of the tertiary structure of the proteins in Aspergillus fumigatus which are similar to Inl A

三、免疫共沉淀

煙曲霉蛋白組與人重組E－cadherin行免疫共沉淀，分離蛋白后行電泳分析。提示與E－cadherin結(jié)合的蛋白出現(xiàn)在43×103～55×103，見圖2，箭頭所示。

圖2 煙曲霉中與E－cadherin可結(jié)合蛋白電泳圖Figure 2 The protein binding to E－cadherin in Aspergillus fumigatus

在43×103～55×103區(qū)間存在一淡色條帶，箭頭所示，對(duì)照組缺失，提示在煙曲霉中存在此區(qū)間蛋白可以和人重組E－cadherin結(jié)合。

討 論

煙曲霉孢子直徑2～3μm，懸浮于空氣中而易被宿主吸入到肺泡中，在宿主免疫力低下時(shí)，孢子躲避了肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬而進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而可發(fā)育成菌絲，侵襲性生長(zhǎng)乃至全身播散。孢子進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞是侵襲性肺曲霉病致病的第一步，研究其侵襲機(jī)制，特別是分子機(jī)制，針對(duì)特定靶位涉及藥物可降低侵襲性肺曲霉病的病死率。

大規(guī)模高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步帶來了生物信息學(xué)快速發(fā)展，使生物信息學(xué)深入到各項(xiàng)生命科學(xué)研究中。在生物信息學(xué)的推動(dòng)下，可以迅速了解蛋白質(zhì)甚至是病原體和宿主相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，推測(cè)出新的蛋白質(zhì)相互作用［13－14］。蛋白質(zhì)相互作用一般是通過特定的、較為保守的結(jié)構(gòu)域完成，我們通過十分明確的李斯特菌InlA與上皮細(xì)胞E－cadherin相互作用機(jī)制推測(cè)煙曲霉中可能與cadherin結(jié)合的蛋白配體，并通過簡(jiǎn)單易行的蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)來初步探討cadherin的配體。免疫共沉淀的方法初步表明，煙曲霉中與上皮細(xì)胞E－cadherin的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為50×103，與生物信息學(xué)推測(cè)的XP748256.1相對(duì)分子質(zhì)量類似，并有穿膜序列，表明了XP748256.1有可能為人肺泡上皮細(xì)胞E－cadherin的配體。從質(zhì)量上分析，我們預(yù)測(cè)的蛋白與實(shí)際的蛋白質(zhì)量上有一定的誤差，這可能由于蛋白合成后存在糖化或其他的一些修飾反應(yīng)而導(dǎo)致質(zhì)量的變化。另外，電泳中的不規(guī)則遷移也可導(dǎo)致測(cè)定的質(zhì)量發(fā)生誤差，但誤差一般不超過30%［15］，而我們目標(biāo)蛋白恰在誤差范圍內(nèi)。當(dāng)然，最終蛋白的測(cè)定還需要質(zhì)譜等檢測(cè)來分析，并通過進(jìn)一步的分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)其作用。

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)現(xiàn)在還不能通過X線晶體衍射或磁共振來測(cè)定結(jié)構(gòu)，因此需要通過生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)方法來推斷蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)［16－17］。同源建模是最常用的建模方法［18］，但只有當(dāng)目標(biāo)研究蛋白的同源性在30%以上時(shí)結(jié)果才相對(duì)可靠。對(duì)同源性在30%以下的蛋白，THREADING預(yù)測(cè)法是近年發(fā)展起來的一種新方法［19］，我們選擇基于此的Phyre對(duì)未知蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)［20］。其主要原理是把未知蛋白質(zhì)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中已明確的蛋白質(zhì)折疊進(jìn)行比對(duì)，選擇最好的模型進(jìn)行構(gòu)建。

總之，通過初步的生物信息學(xué)和分子生物學(xué)推測(cè)，cadherin在煙曲霉蛋白XP748256.1可能為E－cadherin相關(guān)的結(jié)合蛋白，但需進(jìn)一步的分子生物學(xué)技術(shù)來論證。

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