張海婧，周琬琪，張 翼，金 晶，陳曉光

銀屑病是一種易復發(fā)的慢性皮膚病，其發(fā)病與遺傳因素、內(nèi)分泌障礙及免疫功能異常等有關(guān)，但至今尚無明確定論［1，2］，根治性治療仍是一個難題。這除了與其發(fā)病機制復雜有關(guān)外，缺乏系統(tǒng)的、快速的篩選和評價治療藥物的動物模型也是制約對該病深入研究的一個重要原因。目前已有一些動物模型被用于銀屑病的機制研究和藥物篩選，如鼠尾模型、誘發(fā)性動物模型、皮損移植模型、自發(fā)性或基因突變鼠動物模型、轉(zhuǎn)基因鼠動物模型和免疫模型等，但均有一定缺陷。例如，只模擬銀屑病的部分病理特征，造模周期長，費用昂貴，不適合大量、快速篩選藥物等［3-6］。十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)是一種實驗常用的試劑，常被用來作為一種普通的皮膚刺激劑［7，8］。本研究擬利用SDS 建立一種簡單、快速的銀屑病動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠，體重30～35 g，雌雄各半。來源:中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所動物繁育中心［合格證號:SCXK(京)2009-0007］。

1.2 實驗試劑 SDS 購自北京索萊寶科技有限公司。蛋白激酶C β(PKCβ)、白介素1β(IL-1 β)、白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體購自Santa Cruz 公司。ECL發(fā)光液購自北京普利萊公司。

1.3 動物實驗方法 取昆明小鼠16 只，隨機分為2組，8 只為模型組，8 只為對照組。實驗前1 d 全部小鼠背部皮膚去毛。處理方法:10% SDS 2 ml 均勻涂抹模型組小鼠背部皮膚3 cm2，1次/d，共7 d。對照組小鼠給予蒸餾水同樣涂抹7 d。第8 天眼眶取血后脫頸處死全部小鼠。檢測指標包括游標卡尺測量小鼠涂抹區(qū)皮膚厚度，同時觀察皮膚性狀［9］;取小鼠涂抹區(qū)皮膚，用甲醛溶液固定后做病理檢查;Western-blot 法測血清中相關(guān)免疫因子的變化情況。

1.4 Western-blot 檢測 采用Brandford 法測定血清蛋白濃度。配制5%的濃縮膠及10%的分離膠。各取含相同蛋白濃度的血清與5 ×SDS 上樣緩沖液混合后，煮沸5 min，冷卻后上樣。電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用TBST(0.1% Tween-20;10 mmol/L Tris-Cl，pH7.5;3% BSA ;150 mmol/L NaCl)4℃封閉非特異結(jié)合位點過夜。用TBST 液洗膜，10 min/次×3次。將膜與稀釋的一抗(1∶500)室溫孵育3 h，TBST 液洗膜，10 min/次×3次。將膜移入二抗(1∶1000 稀釋)，室溫反應(yīng)2 h。TBST 液洗膜，10 min/次，×3次。將膜平放，滴加發(fā)光液，F(xiàn)uJifilm 化學發(fā)光儀呈像PKCβ、IL-1 β、IL-17、IL-23和TNF-α 等蛋白的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0 軟件，計量資料以表示，進行t 檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SDS 誘發(fā)對小鼠皮膚的影響 對照組小鼠皮膚厚度為(0.60 ±0.02)mm，模型組小鼠皮膚厚度為(0.87 ±0.33)mm。與對照組小鼠相比，模型組小鼠涂抹區(qū)的皮膚厚度顯著增厚(P＜0.05)。模型組可見明顯銀屑病病變體征，如皮膚增厚、紅腫和皮下血管增生。

2.2 病理結(jié)果 對照組小鼠表皮層次較薄，包括基底細胞層、棘細胞層和顆粒細胞層。毛囊自表皮層深入真皮層。真皮層由致密較厚的纖維組織構(gòu)成，散布淋巴管、血管。模型組小鼠表皮層次增多，出現(xiàn)角化過度和角質(zhì)層增厚，真皮層和皮下層可見毛細血管擴張和充血(圖1)。

圖1 病理檢測小鼠皮膚變化情況(HE，×50)

2.3 血清學檢測 模型組小鼠PKCβ、IL-1 β、TNF-α、IL-23 上調(diào);IL-17 無明顯變化(圖2)。

圖2 Western-blot 檢測小鼠血清中免疫因子的變化

3 討 論

銀屑病發(fā)生時，主要表現(xiàn)為表皮增生的異常和免疫系統(tǒng)的激活［10，11］。在本模型小鼠病變皮膚中可以看到角質(zhì)層明顯增厚、血管增生等銀屑病的典型特征。此外，目前研究認為，銀屑病發(fā)生與眾多細胞因子相關(guān)。一些免疫細胞來源的細胞因子如TNF α、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23 等亦能促進角質(zhì)形成細胞的增殖［12，13］。PKC 能促進角質(zhì)形成細胞合成轉(zhuǎn)化生長因子、IL-I、IL-8、TNFα 等。已有研究證明，PKC 的抑制藥能抑制TPA 所誘導的角質(zhì)形成細胞的增殖和炎性反應(yīng)［14，15］。本研究中模型組小鼠血清PKCβ、IL-1 β、TNF-α、IL-23 等因子均出現(xiàn)表達上調(diào)，這與銀屑病發(fā)生時的血清學變化相符。以上結(jié)果表明，SDS 誘發(fā)的小鼠模型可在一定程度上模擬銀屑病發(fā)病時的特征。

目前較為常用的幾種銀屑病動物模型均有一定缺陷，如生物醫(yī)學的鼠尾模型只能用來局部測定藥物對小鼠角質(zhì)層的影響情況;普萘洛爾誘發(fā)的動物模型周期較長，造模需要3周;皮損移植模型需要臨床皮膚樣品;而自發(fā)性或基因突變鼠動物模型、轉(zhuǎn)基因鼠動物模型和免疫模型等造價昂貴。SDS 作為一種較弱的皮膚刺激劑，在體內(nèi)可以引起DC 細胞活化。因而可產(chǎn)生大量炎性反應(yīng)因子，這些炎性反應(yīng)因子與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)［16-18］。本研究SDS誘發(fā)動物模型中，SDS 是一種實驗室常用試劑，昆明小鼠也是一種最常用的實驗動物，兩者均易獲得。此外，本實驗方法簡單、造模周期短，在局部皮膚形狀、病理和血清學等方面也模擬了銀屑病的病變特征，故可以作為一種簡便、快速的銀屑病模型。

值得一提的是，本造模小鼠的銀屑病體征是可逆的，在造模21 d 后小鼠的皮膚基本恢復正常，小鼠血清中表達升高的蛋白也基本恢復至正常水平(數(shù)據(jù)未列出，待另文詳述)。

綜上所述，10% SDS 誘發(fā)的小鼠銀屑病模型在皮膚外觀、病理學和血清學等方面模擬了銀屑病的特征。該模型可以作為一種簡單、快速的銀屑病藥物篩選模型。

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