王本泉，張 玲，黃 雪，陳宗靜，白永恒，吳存造，周蒙滔，陳必成，

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.外科實(shí)驗(yàn)室，2.移植中心，浙江 溫州 325000）

近年來(lái)研究顯示，胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多種基因突變和表觀遺傳學(xué)的變化［1－2］。組蛋白修飾是基因表達(dá)的一種表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式，組蛋白的乙?；癄顟B(tài)在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮非常重要的作用。組蛋白乙酰化狀態(tài)受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）共同調(diào)節(jié)［3］，組蛋白乙?；癄顟B(tài)的失衡可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而HDAC抑制劑可明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)［4］。目前，已發(fā)現(xiàn)多種HDAC抑制劑，曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）是其中具代表性的藥物之一。TSA不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化及化療增敏作用，而且還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。線粒體凋亡途徑是TSA作用的機(jī)制之一［6］，還可能涉及細(xì)胞周期調(diào)控、血管生成和死亡受體等多種途徑［7－8］。

c－Jun氨基端激酶（c－Jun N－ter minal kinase，JNK）又稱(chēng)應(yīng)激活化蛋白激酶（stress－activated pr otein kinase，SAPK），作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）家族中的重要成員，JNK信號(hào)通路在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及多種人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一［9－14］。JNK活化可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，多數(shù)研究認(rèn)為JNK通路活化為化療藥物、紫外線照射等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需［15－17］。JNK通路活化是否參與 TSA誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程尚不清楚。本研究通過(guò)觀察JNK通路在TSA誘導(dǎo)PANC－1細(xì)胞凋亡中的作用，探討TSA誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TSA和Hoechst33258購(gòu)自美國(guó)Sig ma公司，用二甲亞砜（DMSO，Sig ma）溶解至10μmol·L－1，使用前用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。JNK抑制劑（SP600125）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司。CCK－8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenⅠ熒光定量試劑盒購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成（表1）。兔抗人Bax，bcl－2和p－JNK一抗以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔Ig G二抗購(gòu)于英國(guó)Abcam生物公司，胱天蛋白酶3、活性胱天蛋白酶8及p－c－Jun抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。Varioskan酶標(biāo)儀，美國(guó)Ther mo公司；ABI7500熒光PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；DM4000 M熒光顯微鏡，德國(guó)徠卡公司。

Tab.1 Primers used with real－time PCR

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

胰腺癌PANC－1細(xì)胞用含10%胎牛血清、鏈霉素100 g·L－1、青霉素100 g·L－1的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，TSA 0.25，0.5，1和2μmol·L－1處理24 h后，檢測(cè)細(xì)胞存活率，取1μmol·L－1濃度進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分3組，正常對(duì)照組，加入等量培養(yǎng)液共培養(yǎng)，TSA 1.0和TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20μmol·L－1組，處理24 h，Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)凋亡相關(guān)及JNK通路相關(guān)基因的表達(dá)，Wester n印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)及JNK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.3 CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC－1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板（每孔100μl），待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，TSA單獨(dú)處理，細(xì)胞分4組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔：TSA 0.25，0.5，1和2μmol·L－1。TSA＋SP600125聯(lián)合處理細(xì)胞分3組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔：TSA 1.0μmol·L－1，TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20和40μmol·L－1組。以不含TSA和SP600125的培養(yǎng)基處理細(xì)胞作為細(xì)胞對(duì)照組。藥物作用24 h后，各孔加入10μl CCK－8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A450nm）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）＝A實(shí)驗(yàn)組／A對(duì)照組×100%。

1.4 Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡

按照1.2分組處理的細(xì)胞作用24 h后，吸干培養(yǎng)基，用PBS洗2次，4%甲醛液固定10 min，雙蒸水沖洗2次，吸干雙蒸水后，Hoechst33258（5 mg·L－1）室溫下振蕩避光染色5 min，然后用雙蒸水沖洗2次，室溫下涼干后于熒光顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)360 n m，發(fā)射波長(zhǎng)450 n m）下觀察，并隨機(jī)選取位置進(jìn)行拍照。每組隨機(jī)選取100倍鏡下3個(gè)視野，分別計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞凋亡率（%）＝有凋亡小體的細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因及JNK通路相關(guān)基因的表達(dá)

按照1.2分組處理的細(xì)胞作用24 h后，用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，每組吸取2μg RNA樣本在10μl體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：5μl 2×SYBR Green熒光定量試劑、2μl引物（上、下游各1μl，終濃度200 n mol·L－1）、2μl反應(yīng)緩沖液、1μl c DNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃10 min，95℃15 s，62℃10 s，40個(gè)循環(huán)。得到的Ct值用2－△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)。檢測(cè)靶基因包括腫瘤凋亡相關(guān)基因bcl－2和bax，JNK通路相關(guān)基因c－f os，c－Jun以及El k1。

1.6 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白及JNK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

按照1.2分組處理的細(xì)胞作用24 h后，每5×106個(gè)細(xì)胞加100μl細(xì)胞裂解液作用20 min后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，7500×g離心10 min，收集上清液測(cè)蛋白濃度；制備12%聚丙烯酰胺分離膠和4%積層膠，樣品5×SDS上樣緩沖液，設(shè)置恒壓200 V，電泳60 min；設(shè)置恒壓100 V，濕法電轉(zhuǎn)移60 min；轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h；然后加一抗（稀釋在5%脫脂奶粉TBST溶液中）4℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)種屬二抗，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液孵育膜5 min，暗室壓片曝光，顯影定影后膠片保存。運(yùn)用Quantity one軟件分析各個(gè)條帶的積分吸光度（integrated absor bance，IA）值，目的蛋白的IA值與相應(yīng)內(nèi)參蛋白的IA值的比值表示待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。分別檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax，活性胱天蛋白酶8，bcl－2和胱天蛋白酶3蛋白的表達(dá)。

同樣按照上述方法，檢測(cè)TSA 1.0μmol·L－1處理0，1，2，4和6 h，p－JNK和p－c－Jun蛋白的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TSA對(duì)PANC－1細(xì)胞存活率的影響

CCK－8法分析結(jié)果顯示，TSA 0.25～2μmol·L－1單獨(dú)處理，PANC－1細(xì)胞的存活率隨著TSA濃度的增加而降低，顯示TSA對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用具有一定的量效關(guān)系（r＝0.9564，P＜0.05）（圖1）。若加入SP600125 20 和 40μmol·L－1，PANC－1細(xì)胞的存活率較TSA單獨(dú)處理明顯增加（P＜0.05），并且SP600125 40μmol·L－1組明顯高于20μmol·L－1組（P＜0.05）（表2）。

Fig.1 Effect of trichostatin A （TSA）on PANC－1 cell viability by CCK－8 method.Cells were treated wit h TSA for 24 h.±s，n＝3.＊P＜0.05，compared with 0.5μmol·L－1 group；＃P＜0.05，compared with TSA 1μmol·L－1 group.

Tab.2 Effect of SP600125 on TSA induced cell viability

2.2 TSA對(duì)PANC－1細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組細(xì)胞，凋亡率為（1.8±0.4）%（圖2 A），TSA 1μmol·L－1組可見(jiàn)細(xì)胞核形態(tài)明顯異常，可見(jiàn)多個(gè)凋亡小體樣結(jié)構(gòu)（圖 2B），凋亡率為（6.2±4.1）%；TSA＋SP600125組仍可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，但凋亡率明顯下降，為（3.9±0.9）%（圖2C）（n＝3，P＜0.05）。

Fig.2 Effect of TSA on PANC－1 cell apoptosis（Hoechst33258 staining×400）.See Fig.1 f or t he legend.A：nor mal control group；B：TSA 1μmol·L－1 gr oup；C：TSA＋SP600125 20μmol·L－1 gr oup.Arro ws sho w t he apoptotic body－like str uct ures.

2.3 TSA對(duì)PANC－1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及JNK通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)定量RT－PCR分析結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，TSA 1.0μmol·L－1作用PANC－1細(xì)胞24 h后，凋亡相關(guān)基因bax mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01），bcl－2 mRNA明顯降低（P＜0.01），JNK通路相關(guān)基因c－Jun，c－f os和El k1 mRNA明顯升高（P＜0.01）。與 TSA 組相比，TSA＋SP600125組bax mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01），bcl－2 mRNA明顯升高（P＜0.01），c－Jun和c－fos表達(dá)明顯降低（P＜0.01），而El k1 mRNA表達(dá)亦降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

Tab.3 Effect of TSA on mRNA expression of bax，bcl－2，c－Jun，c－fos and Elk1 by real ti me RT－PCR

2.4 TSA對(duì)PANC－1細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

TSA 1.0μmol·L－1作用PANC－1細(xì)胞1 h后，p－c－Jun和 p－JNK 明顯激活，2 h達(dá)峰值（圖 3 A1，A2）。與正常對(duì)照組比較，TSA組促凋亡蛋白Bax和活性胱天蛋白酶8的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）（圖3B1，B2），抗凋亡蛋白bcl－2和胱天蛋白酶3（全長(zhǎng)片段）（圖3C1，C2）的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。與TSA組比較，TSA＋SP600125組的Bax和活性胱天蛋白酶8（圖3B1，B2）的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），bcl－2和胱天蛋白酶3的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。說(shuō)明SP600125對(duì)TSA誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白有一定的影響。

Fig.3 Effect of TSA on p－JNK and p－c－Jun protein（A），Bax and activated caspase 8（B），and bcl－2 and caspase 3 proteins（C）by Wester n blotting.A2，B2 and C3 were t he se miquantitative results of A1，B1 and C1，respectively.A.Lanes 1－5：TSA for 0，1，2，4，and 6 h，respectively.B and C.Lane 1：nor mal control gr oup；lane 2：TSA 1.0μmol·L－1 for 24 h gr oup；lane 3：TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20μmol·L－1 f or 24 h，respectively.±s，n＝3.＊P＜0.05，co mpared wit h 0 h group；＃P＜0.05，co mpared wit h nor mal contr ol gr oup；△P＜0.05，co mpared wit h TSA group.

3 討論

胰腺癌對(duì)化療藥物不敏感，發(fā)展新型化療藥物和化療增敏藥物是改善胰腺癌治療效果的方法之一。HDAC抑制劑可明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡［4］。由于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞呈高度乙?；癄顟B(tài)［8］，因此具有抑制HDAC活性的藥物已成為抗癌治療的新策略。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，TSA可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，JNK通路參與了TSA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

TSA因高效、低毒而在腫瘤治療中受到關(guān)注［18－20］。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，TSA 可通過(guò)誘導(dǎo)P53依賴(lài)的途徑［21］和死亡受體途徑［8］誘發(fā)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)［22］，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。劉維民等［23］研究結(jié)果顯示，TSA作用于人肝癌細(xì)胞SMMC－7721后，可增加抑癌基因p53、促凋亡基因bax的表達(dá)；汪理等［24］的研究提示，TSA誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡可能與其下調(diào)抗凋亡基因bcl－2表達(dá)有關(guān)。我們前期的研究亦證實(shí)，TSA可明顯抑制PANC－1細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且此效應(yīng)與TSA作用的濃度和時(shí)間成正相關(guān)［6］。此外，我們還證實(shí)在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，線粒體通路激活，即bax蛋白表達(dá)升高，bcl－2蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而可能引發(fā)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。

JNK通路參與凋亡過(guò)程，已有報(bào)道認(rèn)為JNK通路激活可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是JNK通路激活卻抑制細(xì)胞凋亡亦有報(bào)道。目前，研究認(rèn)為JNK介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要包括：① 轉(zhuǎn)錄因子途徑，即通過(guò)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)p53，Bax，F(xiàn)asl和TNF等促凋亡蛋白的表達(dá)而介導(dǎo)死亡受體途徑和線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［25］。JNK一旦被激活，磷酸化的JNK即發(fā)生核轉(zhuǎn)位，激活轉(zhuǎn)錄因子c－Jun和Elk－1等，還可誘導(dǎo)BH3－only蛋白（Bid，Bad和Egl1）的表達(dá)，隨后活化Bax等促凋亡蛋白，后者作用于線粒體，促使細(xì)胞色素c釋放入胞漿，細(xì)胞色素c和胱天蛋白酶9結(jié)合，最終作用于胱天蛋白酶3，激活的胱天蛋白酶3與凋亡底物結(jié)合引起細(xì)胞凋亡［15，26－29］。② 非轉(zhuǎn)錄因子途徑，在JNK活化過(guò)程中，部分活化的JNK滯留于細(xì)胞質(zhì)，它們可直接作用于Bcl－2家族，調(diào)控該家族蛋白的活性，從而介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，此過(guò)程沒(méi)有新基因的表達(dá)。

為了驗(yàn)證JNK通路在TSA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用，本研究通過(guò)加入JNK抑制劑SP600125阻斷JNK通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TSA＋SP600125聯(lián)合組的細(xì)胞存活率明顯高于TSA單獨(dú)處理組，JNK通路抑制劑明顯降低TSA誘導(dǎo)PANC－1細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。TSA作用PANC－1細(xì)胞1 h后，JNK信號(hào)通路明顯激活，2 h達(dá)峰值，表明JNK信號(hào)通路可能參與TSA抗腫瘤的機(jī)制。高濃度TSA作用24 h后，JNK通路相關(guān)基因的表達(dá)均較對(duì)照組增高。PANC－1細(xì)胞bax mRNA，bax蛋白、活性胱天蛋白酶8的表達(dá)明顯升高，bcl－2 mRNA和bcl－2蛋白的表達(dá)明顯降低，推測(cè)TSA可能激活了線粒體凋亡程序，Bax／bcl－2失平衡而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。阻斷JNK信號(hào)通路后，JNK通路相關(guān)基因的表達(dá)則降低，線粒體凋亡途徑受到抑制，bax mRNA和Bax及活性胱天蛋白酶8蛋白的表達(dá)均降低，bcl－2 mRNA和bcl－2蛋白表達(dá)升高。亦有研究發(fā)現(xiàn)，在不同類(lèi)型的細(xì)胞中，受不同類(lèi)型的刺激，JNK通路活化不導(dǎo)致凋亡，而可能促進(jìn)細(xì)胞增殖分化。其可能的解釋為，人體內(nèi)可能存在多種JNK的同工酶，在不同的細(xì)胞中，或處于細(xì)胞發(fā)育的不同階段，它們的表達(dá)水平不同，對(duì)刺激的反應(yīng)方式亦存在差異。TSA在其他類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞中是否依賴(lài)JNK通路發(fā)揮促凋亡作用尚需要進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究結(jié)果表明，TSA可抑制PANC－1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，JNK通路可能參與此過(guò)程。

［1］Hr uban RH，Iacobuzio－Donahue C，Wilentz RE，Goggins M，Ker n SE.Molecular pat hology of pancreatic cancer［J］.Cancer J，2001，7（4）：251－258.

［2］Ueki T， Toyota M， Sohn T， Yeo CJ，Issa JP，Hr uban RH，et al.Hyper met hylation of multiple genes in pancreatic adenocarcino ma［J］.Cancer Res，2000，60（7）：1835－1839.

［3］Kouzarides T.Histone acetylases and deacetylases in cell pr oliferation［J］.Curr Opin Genet Dev，1999，9（1）：40－48.

［4］Monneret C.Histone deacetylase inhibitors［J］.Eur J Med Chem，2005，40（1）：1－13.

［5］Piacentini P，Donadelli M，Costanzo C，Moore PS，Pal mieri M，Scarpa A.Trichostatin A enhances the response of chemot herapeutic agents in inhibiting pancreatic cancer cell proliferation［J］.Virchows Arch，2006，448（6）：797－804.

［6］Yang YX，Hu SK，Ye XZ，Bai YH，Wang SL，Liu B，et al.Effect of trichostatin A on expression of apoptitosis－related genes and metastasis－related genes in hu man pancreatic cancer PANC－1 cells［J］.Chin J Phar macol Toxicol（中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2012，26（5）：624－629.

［7］Tian R，Qin RY，Du ZY，Xia W.Antitumor effect of tu mor necr osis fact or－related apoptosis－inducing ligand gene transfection mediated by adenovir us in hu man pancreatic carcino－ma cell［J］.Chin J Gen Sur g（中國(guó)普通外科雜志），2006，15（11）：821－825.

［8］Ki m HR，Ki m EJ，Yang SH，Jeong ET，Par k C，Lee JH，et al.Trichostatin A induces apoptosis in l ung cancer cells via si multaneous activation of t he deat h receptor－mediated and mit ochondrial pat h way？［J］.Exp Mol Med，2006，38（6）：616－624.

［9］Huang Y，Huang X，Cai J，Ye F，Qin Q.Involvement of t he mit ogen－activated pr otein kinase pat h way in soft－shelled turtle iridovir us－induced apoptosis［J］.Apoptosis，2011，16（6）：581－593.

［10］Thévenin AF，Zony CL，Bahnson BJ，Col man RF.Activation by phosphor ylation and purification of hu man c－Jun N－ter minal kinase（JNK）isof or ms in milligram a mounts［J］.Protein Expr Purif，2011，75（2）：138－146.

［11］Nix P，Hisa mot o N，Matsu mot o K，Bastiani M.Axon regeneration requires coor dinate activation of p38 and JNK MAPK pat h ways［J］.Pr oc Natl Acad Sci USA，2011，108（26）：10738－10743.

［12］Kovac A，Zilka N，Kaz merova Z，Cente M，Zil kova M，Novak M.Misfolded tr uncated pr oteinτinduces innate i mmune response via MAPK pat h way［J］.J Immunol，2011，187（5）：2732－2739.

［13］Shaulian E，Karin M.AP－1 as a regulator of cell life and deat h［J］.Nat Cell Biol，2002，4（5）：E131－E136.

［14］Hong JY，Lebofsky M，F(xiàn)ar hood A，Jaeschke H.Oxidant stressinduced liver injury in vivo：role of apoptosis，oncotic necrosis，and c－Jun NH2－ter minal kinase activation［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2009，296（3）：G572－G581.

［15］Brnjic S，Olofsson MH，Havelka AM，Linder S.Chemical biology suggests a role for calciu m signaling in mediating sustained JNK activation during apoptosis［J］.Mol Biosyst，2010，6（5）：767－774.

［16］Ber mudez O， Pagès G， Gi mond C. The dual－specificity MAP kinase phosphatases：critical roles in develop ment and cancer［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，299（2）：C189－C202.

［17］Igaki T.Correcting develop mental errors by apoptosis：lessons from Drosophila JNK signaling［J］.Apoptosis，2009，14（8）：1021－1028.

［18］Marks PA，Richon VM，Rif kind RA.Histone deacetylase inhibitors：inducers of differentiation or apoptosis of transfor med cells［J］.J Natl Cancer Inst，2000，92（15）：1210－1216.

［19］Suzuki T，Yokozaki H，Kuniyasu H，Hayashi K，Naka K，Ono S，et al.Effect of trichostatin A on cell growth and expression of cell cycle－and apoptosis－related molecules in human gastric and oral carcinoma cell lines［J］.Int J Cancer，2000，88（6）：992－997.

［20］Park WH，Jung CW，Park JO，Ki m K，Kim WS，Im YH，et al.Trichostatin inhibits the growth of ACHN renal cell carcino ma cells via cell cycle arrest in association with p27，or apoptosis［J］.Int J Oncol，2003，22（5）：1129－1134.

［21］Nakajima S，Niizeki H，Tada M，Nakagawa K，Kondo S，Okada F，et al.Trichostatin A with adenovirus－mediated p53 gene transfer synergistically induces apoptosis in breast cancer cell line MDA－MB－231［J］.Oncol Rep，2009，22（1）：143－148.

［22］Reddy RM，Yeow WS，Chua A，Nguyen DM，Baras A，Ziauddin MF，et al.Rapid and profound potentiation of Apo2 L／TRAIL－mediated cytotoxicity and apoptosis in thoracic cancer cells by the histone deacetylase inhibitor trichostatin A：the essential role of the mitochondria－mediated caspase activation cascade［J］.Apoptosis，2007，12（1）：55－71.

［23］Liu WM，Yan KL，Wu ZQ.The inhibition of TSA to hepatoma cell SMMC－7721 and its mechanism［J］.J Mod Oncol（現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)），2007，15（10）：1373－1375.

［24］Wang L，Zhou W，Zhang JH，Liu T，Wang CY.Trichostatin A（TSA）suppresses the growth of pancreatic adenocarcinoma cells［J］.Chin J Gen Surg（中國(guó)普通外科雜志），2010，19（3）：234－238.

［25］Guan QH，Pei DS，Xu TL，Zhang GY.Brain ischemia／reperfusion－induced expression of DP5 and its interaction with Bcl－2，thus freeing Bax from Bcl－2／Bax dimmers are mediated by c－Jun N－ter minal kinase（JNK）pathway［J］.Neurosci Lett，2006，393（2－3）：226－230.

［26］Bogoyevitch MA，Ngoei KR，Zhao TT，Yeap YY，Ng DC.c－Jun N－ter minal kinase（JNK）signaling：recent advances and challenges［J］.Biochi m Biophys Acta，2010，1804（3）：463－475.

［27］Séverin S，Ghevaert C，Mazharian A.The mitogen－activated protein kinase signaling pathways：role in megakaryocyte differentiation［J］.J Thromb Haemost，2010，8（1）：17－26.

［28］Geest CR，Coffer PJ.MAPK signaling pathways in the regulation of hematopoiesis［J］.J Leukoc Biol，2009，86（2）：237－250.

［29］Yu MK，Lee YH，Yoon MR，Bhattarai G，Lee NH，Ki m TG，et al.Attenuation of AH26－induced apoptosis by inhibition of SAPK／JNK pathway in MC－3T3 E1 cells［J］.J Endod，2010，36（12）：1967－1971.