仇士東，劉兆華，劉兆平

（1.山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室，山東 濟(jì)南 250101；2.山東大學(xué)新藥評價中心，山東 濟(jì)南 250012）

隨著中藥注射劑在臨床的廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)，尤其是嚴(yán)重速發(fā)型超敏反應(yīng)逐年增多，嚴(yán)重制約了現(xiàn)有品種的臨床應(yīng)用。中藥注射劑的速發(fā)型超敏反應(yīng)已成為當(dāng)前藥物毒理學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題。速發(fā)型超敏反應(yīng)包括Ⅰ型超敏反應(yīng)和類過敏反應(yīng)（anaphylactoid reaction）［1］，其中類過敏反應(yīng)的研究相對較少。同Ⅰ型超敏反應(yīng)相似，類過敏反應(yīng)也是通過激活組織內(nèi)的肥大細(xì)胞或循環(huán)中的嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒釋放過敏介質(zhì)，作用于平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，引發(fā)局部或系統(tǒng)性過敏癥狀。但兩者激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的機(jī)制和發(fā)病特征具有明顯不同［1］，最主要區(qū)別在于類過敏反應(yīng)首次給藥即發(fā)生反應(yīng)，且具有劑量依賴性［2］，在臨床上容易被誤診為Ⅰ型超敏反應(yīng)。據(jù)國外統(tǒng)計，77%的臨床過敏反應(yīng)為類過敏反應(yīng)［1］。據(jù)國內(nèi)統(tǒng)計，雙黃連注射劑的不良反應(yīng)居中藥注射劑之首，大多為首次給藥即發(fā)生過敏反應(yīng)。因此推測，雙黃連注射劑可能引起類過敏反應(yīng)。雙黃連注射劑類過敏反應(yīng)機(jī)制研究對中藥注射劑的發(fā)展具有重要意義。本研究采用大鼠、犬和小鼠等動物模型研究雙黃連注射劑類過敏反應(yīng)的特點，為其他中藥注射劑的類過敏反應(yīng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BN大鼠，體質(zhì)量170～200 g，雌性，SPF級，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2006－0009。比格犬，體質(zhì)量10～12 kg，雌性，購于上海市新岡實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007－0009。C57BL／6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌性，SPF級，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2006－0009。

1.2 試劑和儀器

注射用雙黃連，哈藥集團(tuán)中藥二廠，批號：1012236；Co mpound 48／80，批號：021 M4011 V；伊文思藍(lán)，批號：MKBH2094 V，美國Sig ma公司；大鼠和犬組胺及補(bǔ)體SC5b－9，C4d和Bb ELISA試劑盒，美國Rapid Bio公司。Infinite 200多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；MP150多導(dǎo)生理記錄儀，美國Biopac公司。

1.3 BN大鼠分組及血壓、血清Ig E、組胺以及補(bǔ)體SC5b－9、C4d和Bb的測定

取BN大鼠25只，平均分為5組，分別為生理鹽水，Compound 48／80 0.34 mg·kg－1以及雙黃連注射劑187.5，375和750 mg·kg－1組，采用微量注射泵恒速120 ml·h－1靜脈推注給予生理鹽水、Co mpound 48／80和雙黃連注射劑。根據(jù)《中國藥典》2010版一部關(guān)于雙黃連注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其臨床擬用量為60 mg·kg－1，根據(jù)體質(zhì)量折算，大鼠用量375 mg·kg－1相當(dāng)于臨床用量。

ip給予3%戊巴比妥鈉1.5 ml·kg－1麻醉大鼠，束縛于固定板。大鼠頸部剃毛，消毒，剪開頸部皮膚，用眼科鑷分離一側(cè)頸動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動脈夾夾住近心端，在動脈夾和遠(yuǎn)心端結(jié)扎處，小心剪取一小口插入充滿肝素鈉溶液的動脈插管并結(jié)扎，打開動脈夾，記錄血壓。分離對側(cè)頸靜脈，做靜脈插管，連接注射器，管內(nèi)充滿肝素鈉溶液。給藥前10 min，給藥后0，2，10，30和60 min記錄大鼠動脈血壓，血壓采用Biopac Acknowledge 4.1軟件采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)值統(tǒng)計比較，以藥前平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）為基準(zhǔn)，降壓幅度≥2.66 k Pa時，認(rèn)為藥物具有明顯的降壓作用。同時在給藥前10 min，給藥后0，2，10，30和60 min分別取頸動脈血，每次約0.6 ml，同時補(bǔ)充相同體積的肝素鈉溶液以保持血容量不變。血液靜置30 min后，1000×g離心10 min取上清，置－80℃凍存。大鼠血清中Ig E、組胺及補(bǔ)體SC5b－9、C4d和Bb均采用ELISA試劑盒檢測。每只大鼠每個指標(biāo)均設(shè)2個平行樣。

1.4 比格犬的分組及血壓、血清IgE、組胺以及補(bǔ)體SC5b－9、C4d和Bb的測定

取比格犬20只，分為5組，每組4只，分別為生理鹽水，Compound 48／80 0.1 mg·kg－1及雙黃連注射劑56.4、112.8和225.6 mg·kg－1組，分別給予生理鹽水、Compound 48／80和雙黃連注射劑。根據(jù)《中國藥典》2010版一部關(guān)于雙黃連注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)體質(zhì)量折算，犬用量為112.8 mg·kg－1。

比格犬前肢靜脈注射3%戊巴比妥鈉1 ml·kg－1麻醉，固定于保溫手術(shù)臺上。腹股溝處消毒，分離股靜脈，做靜脈插管，以備注射藥物。分離同側(cè)股動脈，做動脈插管，連接壓力傳感記錄血壓信號。血壓穩(wěn)定后，采用微量注射泵恒速120 ml·h－1給藥，全程記錄血壓。采用Biopac Acknowledge 4.1軟件采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)值統(tǒng)計比較，以藥前MAP為基準(zhǔn)，降壓幅度≥2.66 k Pa時，認(rèn)為藥物具有明顯的降壓作用。同時股動脈定點采血，每次2 ml，采血后補(bǔ)足相同體積的肝素鈉溶液以保持血容量不變。于藥前20 min，藥后2，10，30，60和120 min采血。血液靜置30 min后，1000×g離心10 min取上清，置－80℃凍存。犬血清中Ig E、組胺及補(bǔ)體SC5b－9、C4d和Bb均采用ELISA試劑盒檢測，每只犬每個指標(biāo)均設(shè)2個平行樣。

1.5 小鼠的分組及皮膚血管滲透性的測定

取C57BL／6小鼠20只，拉丁方分組法分成5組，每組5只，分為生理鹽水，Co mpound 48／80 0.1 mg·kg－1及雙黃連270，540和1080 mg·kg－1組，分別給予生理鹽水，Co mpound 48／80和雙黃連注射劑。根據(jù)《中國藥典》2010版一部關(guān)于雙黃連注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，小鼠用量為540 mg·kg－1。

小鼠ip給予1.5%戊巴比妥鈉5 ml·kg－1麻醉后，剃去背部毛發(fā)。尾靜脈注射50μl 0.5%伊文思藍(lán)溶液，15 min后分別在每只小鼠背部左右側(cè)sc給予雙黃連注射劑，60 min后處死小鼠，取背部皮膚，剪碎后組織浸出液（丙酮∶生理鹽水＝7∶3）（V／V）10 ml浸泡48 h，并測量其610 n m處吸光度值，計算伊文思藍(lán)含量（μg·c m－2）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雙黃連注射劑致大鼠平均動脈壓降低

大鼠給予雙黃連注射劑后，全程監(jiān)測血壓的變化。如圖1所示，Compound 48／80組在0～2 min MAP由14.7 k Pa降至8.0 k Pa，在2 min后出現(xiàn)了MAP的劇烈變化，且在60 min以內(nèi)未見MAP的恢復(fù)。與生理鹽水組比較，雙黃連注射劑375和750 mg·kg－1組給藥后2～10 min MAP顯著降低（P＜0.05），而187.5 mg·kg－1組 MAP未見明顯變化。

Fig.1 Effect of Shuanghuanglian injection（SHLI）on mean artery pressure（MAP）of r ats.The MAP of rats was detected 10 min bef ore ad ministration（－10 min）and 0，2，10，30 and 60 min after ad ministration.±s，n＝5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with nor mal saline group.

2.2 雙黃連注射劑致大鼠血清組胺和補(bǔ)體SC5b－9含量升高

由表1和表2可見，大鼠給藥后2～10 min，與給藥前（－10 min）比較，雙黃連注射劑375和750 mg·kg－1組組胺升高（P＜0.05，P＜0.01），Ig E水平未見明顯變化。Co mpound 48／80組與給藥前比較組胺升高（P＜0.01），Ig E水平不變，為典型的類過敏反應(yīng)特點。由表3可見，與生理鹽水組比較，雙黃連注射劑375和750 mg·kg－1組給藥后2～10 min SC5b－9含量升高（P＜0.05）。由圖2可見，大鼠給予雙黃連注射劑后，與生理鹽水組比較，補(bǔ)體C4d和Bb濃度未見明顯變化。由此初步判斷，雙黃連注射劑可導(dǎo)致類過敏反應(yīng)，但不能完全確定是否激活了大鼠的補(bǔ)體途徑而引發(fā)類過敏反應(yīng)。

Tab.1 Effect of SHLI on serum histamine level of rats

Tab.2 Effect of SHLI on ser um IgE level of rats

Tab.3 Effect of SHLI on ser um SC5b－9 level of rats

Fig.2 Effect of SHLI on complements Bb and C4d levels in rat seru m.See Fig.1 for t he rat treat ment.±s，n＝5.

2.3 雙黃連注射劑致比格犬平均動脈壓降低

雙黃連注射劑按比格犬正常給藥濃度（26.7 g·L－1），以不同的靜脈給藥速度給予比格犬，全程記錄MAP的變化。如圖3所示，雙黃連注射劑在300 ml·h－1時引起 MAP的劇烈變化（圖3 A），同時出現(xiàn)呼吸窘迫癥狀。降低給藥速度至120 ml·h－1，MAP未見明顯降低（圖3B），呼吸亦恢復(fù)正常。因此，本研究采用120 ml·h－1速度靜脈給藥。

Fig.3 Effect of feed rate of SHLI 26.7 g·L－1 on MAP of Beagle dogs.A：SHLI 300 ml·h－1；B：SHLI 120 ml·h－1；C：normal saline 300 ml·h－1.

2.4 雙黃連注射劑致比格犬血清組胺和SC5b－9含量升高

由表4可見，與生理鹽水組比較，雙黃連注射劑56.4，112.8和225.6 mg·kg－1組在比格犬給藥后2～10 min組胺含量升高（P＜0.05，P＜0.01）。由表5可見，雙黃連注射劑56.4，112.8和225.6 mg·kg－1組Ig E未見明顯變化。由表6可見，雙黃連注射劑56.4，112.8和225.6 mg·kg－1組給藥后2～30 min犬血清中SC5b－9升高（P＜0.05，P＜0.01）。Co mpound 48／80組組胺升高，Ig E 不變，且SC5b－9不變，其為典型的非補(bǔ)體介導(dǎo)的類過敏反應(yīng)。由圖4可看出，雙黃連注射劑56.4，112.8和225.6 mg·kg－1組補(bǔ)體Bb均未發(fā)生明顯變化，C4d均升高（P＜0.01）。據(jù)此可初步判斷，雙黃連注射劑可導(dǎo)致比格犬類過敏反應(yīng)，且可能屬于補(bǔ)體介導(dǎo)的類過敏反應(yīng)。

Tab.4 Effect of SHLI on ser um histamine level of Beagle dogs

Tab.5 Effect of SHLI on serum IgE level of Beagle dogs

Tab.6 Effect of SHLI on ser um complement SC5b－9 level of Beagle dogs

Fig.4 Effect of SHLI on ser um complements Bb（A）and C4d（B）level of Beagle dogs.See Tab.4 f or the Beagle dogtreat ment.±s，n＝4.＊＊P＜0.01，co mpared wit h bef ore treat ment（－20 min）.

2.5 雙黃連注射劑致小鼠皮膚血管滲透性增加

皮膚藍(lán)斑實驗結(jié)果如圖5和圖6所示。與生理鹽水組比較，Co mpound 48／80組出現(xiàn)明顯的藍(lán)斑浸潤（圖5B），皮膚組織中依文思藍(lán)含量升高（P＜0.01）。雙黃連注射劑270，540和1080 mg·kg－1組亦出現(xiàn)藍(lán)斑浸潤（圖5C，D和E），依文思藍(lán)含量升高（P＜0.01），且隨給藥劑量的增加，藍(lán)斑浸潤加重，依文思藍(lán)含量升高（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of SHLI on skin vascular per meability of mice.The mice were iv given 0.5%Evans blue solution 50μl in t he tail.Fifteen minutes later，SHLI was sc given on t he back skin of mice.Sixty minutes later，t he vascular per meability was measured.A：nor mal saline；B：Compound 48／80 0.1 mg·kg－1；C，D and E：SHLI 270，540 and 1080 mg·kg－1，respectively.

Fig.6 Effect of SHLI on Evans blue content in back skin of mice.See Fig.5 for t he mouse treat ment.±s，n＝5.＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal saline gr oup.

3 討論

類過敏反應(yīng)的研究模型主要分為體外模型和動物模型。體外模型包括細(xì)胞模型［3－4］和體外補(bǔ)體激活模型等。動物模型主要有犬［5］、大鼠、小鼠［6］、豚鼠［7］、猴［7］和豬［8］等。每種模型大都以靶細(xì)胞（肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞）為研究對象，探求其類過敏介質(zhì)的釋放機(jī)制。類過敏反應(yīng)動物模型在國內(nèi)的研究相對成熟。組胺、類胰蛋白酶、特異性Ig E和補(bǔ)體等物質(zhì)均可以作為生物標(biāo)志物，用于類過敏反應(yīng)的診斷［9］。組胺是類過敏反應(yīng)的重要指標(biāo)，較為客觀準(zhǔn)確，但組胺正常值有較大的個體差異。血清組胺水平與臨床變應(yīng)癥狀發(fā)生的一致性尚有待于進(jìn)一步確證［9］。單獨依靠組胺升高來判斷致敏性易于產(chǎn)生誤判。為此，本研究增加了血壓、Ig E和補(bǔ)體等指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷，增加了評價結(jié)果的客觀性。

補(bǔ)體系統(tǒng)廣泛參與機(jī)體抗微生物防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)，是體內(nèi)具有重要生物學(xué)作用的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)［10］。補(bǔ)體介導(dǎo)的類過敏反應(yīng)是類過敏反應(yīng)類型中重要組成部分。補(bǔ)體系統(tǒng)激活過程依據(jù)其起始順序不同，可分為經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑3條途徑。補(bǔ)體C4d和Bb分別是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑的產(chǎn)物，測定這兩個指標(biāo)可以判斷不同的激活途徑［11］。本研究的設(shè)計思路是先進(jìn)行組胺和IgE的檢測，若出現(xiàn)組胺升高且Ig E不變的情況，可懷疑為類過敏反應(yīng)，再進(jìn)一步測定補(bǔ)體激活情況，即檢測補(bǔ)體SC5b－9含量的變化。若SC5b－9含量升高，則再檢測補(bǔ)體通路的標(biāo)志物C4d和Bb，從而進(jìn)一步判斷激活的具體補(bǔ)體通路。

根據(jù)比格犬的實驗結(jié)果，給予雙黃連注射劑后血壓降低，血清組胺含量升高，Ig E含量不變，SC5b－9升高，說明雙黃連注射劑可以引起類過敏反應(yīng)。給雙黃連注射劑后血清中C4d含量明顯上升，而Bb含量未見顯著性改變，該結(jié)果提示雙黃連注射劑激活補(bǔ)體系統(tǒng)可能是通過激活經(jīng)典途徑實現(xiàn)的。根據(jù)大鼠的實驗結(jié)果，給予雙黃連注射劑后血壓降低，血清組胺含量升高，Ig E含量不變，SC5b－9升高，但未見C4d和Bb含量的明顯變化，可見大鼠相對犬來說，對補(bǔ)體的變化不甚明顯。

小鼠血管滲透性實驗中，根據(jù)藍(lán)斑面積的大小和組織浸提液提取的伊文思藍(lán)的含量變化，可判斷給藥后血管滲透性的大小。給予雙黃連注射劑后，小鼠出現(xiàn)劑量依賴性血管通透性增高，血管反應(yīng)程度隨劑量增高而加重，這可以認(rèn)為是類過敏反應(yīng)的證據(jù)。小鼠的免疫系統(tǒng)具有非常好的特異性，小鼠皮膚中含有豐富的肥大細(xì)胞，非常適合具有直接刺激肥大細(xì)胞特點的藥物的篩選。

根據(jù)本研究不同動物模型的比較可知，犬和小鼠的類過敏反應(yīng)模型具有一定的靈敏性。比較而言，大鼠模型對類過敏反應(yīng)不太敏感。這也正好驗證了犬的類過敏模型的科學(xué)性。Szebeni等［12］比較了大鼠、豬和犬對脂質(zhì)體的類過敏反應(yīng)敏感性，認(rèn)為大鼠對血壓變化不甚敏感，犬和豬可用于制備類過敏反應(yīng)檢測模型。因犬對血壓的變化非常敏感，MAP的檢測具有很好的靈敏性。并且，犬的補(bǔ)體系統(tǒng)較發(fā)達(dá)，亦非常適合用于補(bǔ)體介導(dǎo)的類過敏反應(yīng)的評價。閆位娟［13］比較了小鼠、豚鼠和比格犬用于評價類過敏反應(yīng)的敏感性和準(zhǔn)確性，結(jié)果也表明比格犬為最佳實驗動物。

綜上所述，雙黃連注射劑可引起類過敏反應(yīng)，其特點是既可激活皮膚中的肥大細(xì)胞又可激活血液中的嗜堿性粒細(xì)胞，且具有補(bǔ)體介導(dǎo)的類過敏反應(yīng)的特征。在其他種屬的動物以及人體上是否具有相似的反應(yīng)，尚待進(jìn)一步研究。

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