李金優(yōu)，宋順德，毛連根，曾豆豆，史建蓉，陳季強(qiáng)，李子剛，湯慧芳

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.浙江省呼吸藥物研究實(shí)驗(yàn)室，2.國(guó)家理科基地，浙江杭州 310058;3.附屬兒童醫(yī)院，浙江杭州 310003;4.附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江杭州 310000)

特發(fā)性肺纖維化以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征，這種實(shí)質(zhì)病變具有不可逆性和嚴(yán)重的致死率，曾被認(rèn)為是一種慢性炎癥過(guò)程。但目前研究表明，纖維化的反應(yīng)是由異常激活的肺泡上皮細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，這些細(xì)胞產(chǎn)生的介質(zhì)通過(guò)肺部間質(zhì)細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞灶形成，吸引循環(huán)纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞灶分泌過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)，以膠原纖維為主，造成瘢痕和肺結(jié)構(gòu)的破壞[1]。目前尚無(wú)有效的治療手段阻止或逆轉(zhuǎn)纖維化的過(guò)程。因此，尋找在上皮損傷過(guò)度修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用的藥物，成為探索阻止和逆轉(zhuǎn)肺纖維化過(guò)程的關(guān)鍵。

磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDE)是細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP的水解酶，可維持細(xì)胞內(nèi)第二信使?jié)舛绕胶?，在信?hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在肺部疾病中，PDE4是目前關(guān)注較多的一個(gè)亞型，PDE4有A，B，C和D 4個(gè)亞型，其中PDE4B亞型因在炎癥細(xì)胞和組織中表達(dá)較廣泛而倍受關(guān)注[2－3]。據(jù)報(bào)道，PDE4抑制劑對(duì)博來(lái)霉素(bleomycin)誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠有治療作用[4－5]，但由于目前PDE4抑制劑的亞型選擇性不強(qiáng)，究竟是何種PDE4亞型在起作用尚不清楚。本研究采用博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型，研究PDE4B mRNA和蛋白表達(dá)在纖維化形成不同時(shí)期的變化，同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)化 生 長(zhǎng) 因 子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白細(xì)胞介素 6(interleukin-6，IL-6)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)和IL-1β等的分泌，以期闡明PDE4B亞型在肺纖維化過(guò)程中所發(fā)揮的作用，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和儀器

C57BL/6J小鼠，雄性，7～8周，體質(zhì)量20～22 g，由浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):2007000526749。博來(lái)霉素，日本化藥株式會(huì)社;實(shí)時(shí)PCR相關(guān)試劑包括dNTP混合物、Oligo(dT)18引物、RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和 SYBR Rremix Ex TaqTM，寶生物工程(大連)有限公司;膠原含量測(cè)定試劑盒，英國(guó)Biocolor公司;小鼠TGF-β1和MIP-2 ELISA試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司;髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程有限公司;小鼠β肌動(dòng)蛋白和PDE4B引物，上海生工生物工程有限公司合成;IL-6和 IL-1β ELISA試劑盒，美國(guó) R＆D Systems公司。CFX96型熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司;CM 1850型冰凍切片機(jī)，德國(guó)Leica公司。

1.2 模型制備和分組

采用4%水合氯醛280 mg·kg－1麻醉小鼠，有創(chuàng)氣道給藥法滴入生理鹽水配制的博來(lái)霉素2.5 mg·kg－1。正常對(duì)照組滴入等體積的生理鹽水。給予博來(lái)霉素后第3，7，14，21和28天處死小鼠，分不同批次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，留取肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)并留取肺組織。

1.3 肺組織病理學(xué)觀察

小鼠股動(dòng)脈放血處死后，留取肺組織用4%甲醛固定，制備石蠟切片，進(jìn)行Masson染色，觀察肺組織纖維化改變，以確定造模是否成功。Masson染色呈藍(lán)色的即沉積的膠原纖維。

1.4 BALF收集和處理

取1 ml生理鹽水灌洗肺組織得到BALF，混勻后取50 μl用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)，余下以500×g離心5 min，取上清液分裝，凍存于 －80℃，余下30 μl小心吹勻沉積細(xì)胞，均勻涂片，晾干并固定，瑞氏吉姆薩染色，高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)目。

1.5 ELISA測(cè)定BALF中炎癥因子含量

取BALF上清液按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定 TGF-β1，IL-6 和 MIP-2 含量。

1.6 肺組織MPO活性和膠原蛋白含量測(cè)定

右肺組織用生理鹽水制備成10%的組織勻漿，取450 μl測(cè)定 MPO活性，剩余勻漿于12000×g離心10 min取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定膠原含量，并取5 μl上清液進(jìn)行總蛋白含量測(cè)定。MPO和膠原含量測(cè)定結(jié)果皆為上清液每克總蛋白中的MPO活性和膠原含量。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定肺組織中PDE4B mRNA表達(dá)

取液氮固定的左肺組織加入1 ml Trizol于冰浴中勻漿，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于－20℃保存。以cDNA為模板，用PDE4B引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，內(nèi)參照為β肌動(dòng)蛋白。小鼠 β肌動(dòng)蛋白引物，上游(5'-3'):GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC;下游(5'-3'):GACTCATCGTACTCCTGCTTGC。小鼠 PDE4B引物，上游(5'-3'):CCAGTTCCTGTTATCTTC;下游(5'-3'):TCGCAACATGGTACACTG。擴(kuò)增條件為:95℃10 s，48.9℃30 s，72℃45 s，40 個(gè)循環(huán)。以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，目的基因的表達(dá)用相對(duì)定量法計(jì)算，即目的基因2－ΔCt/β 肌動(dòng)蛋白2－ΔCt，其中Ct值是PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)，可通過(guò)GeneAmp5700基因序列分析軟件讀出并計(jì)算，ΔCt=Ct的平均值－中間值。

1.8 免疫組化法檢測(cè)PDE4B蛋白分布

冰凍組織包埋后，切成4 μm切片，室溫30 min后用丙酮固定10 min，PBS清洗，用3%H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。用PBS小心洗5次后使用兔抗PDE4B多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，陰性對(duì)照組用PBS代替一抗。PBS清洗5次去除抗體，5%BSA封閉10 min。PBS清洗后加入二抗，室溫孵育30 min，PBS清洗后加入DAB顯色10 min，清洗后加入蘇木精染色5 min，PBS清洗后浸入無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，于顯微鏡下觀察并拍片，PDE4B陽(yáng)性部分顯色為棕色。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行分析，選擇測(cè)量積分吸光度(integrated absorbance，IA)。每組6張切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)區(qū)域，每個(gè)高倍鏡視野測(cè)5個(gè)IA，每組有300個(gè)平均IA值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 博來(lái)霉素刺激后肺組織的病理變化

圖1顯示博來(lái)霉素誘導(dǎo)致肺組織氣道重塑和纖維化過(guò)程。正常對(duì)照組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰且完整，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。模型組小鼠在纖維化早期(第7天)，主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮細(xì)胞排列不規(guī)則并脫落，肺泡結(jié)構(gòu)少量破壞(圖1C);第14天膠原開(kāi)始形成，并沉積于氣道附近(圖1D);在纖維化后期(第21天和第28天)，間質(zhì)細(xì)胞大量增殖，膠原大量沉積，肺泡組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，間隔消失形成空洞(圖1E，F(xiàn))。上述變化提示肺纖維化模型制備成功。

2.2 博來(lái)霉素刺激后小鼠肺組織BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)的變化

表1為博來(lái)霉素刺激后第3，7，14，21和28天小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目?？梢钥闯觯﹣?lái)霉素刺激后第3天白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目均達(dá)到峰值，隨后逐漸回落。

2.3 博來(lái)霉素刺激后BALF中炎癥因子MIP-2，IL-6，IL-1β和 TGF-β1含量的變化

由表2看出，與正常對(duì)照組比較，IL-1β在博來(lái)霉素刺激后快速升高(P＜0.01)，第3天達(dá)到峰值，之后逐漸回落接近正常水平;IL-6也快速升高(P＜0.01)，在第3天達(dá)到峰值，隨后快速回落;MIP-2則隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，第28天是對(duì)照組的173%(P＜0.01);TGF-β1在第7天達(dá)峰值之后逐漸回落。

Fig.1 Bleomycin-induced histopathological changes in lung tissue of mice(Masson staining).On the 3rd，7th，14th，21st and 28th days after the mice were intratracheal instillated bleomycin 2.5 mg·kg －1，the histopathological changes in lung tissue were observed to evaluate lung injury.A:normal group;B －F:3，7，14，21 and 28 d groups，respectively.

Tab.1 Bleomycin-induced changes of total leukocyte and differential cell counts in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of mice

Tab.2 Bleomycin-induced changes of interleukin-1β (IL-1β)，IL-6，macrophage inflammatory protein-2(MIP-2)and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in BALF of mice

2.4 博來(lái)霉素刺激后肺組織MPO活性和膠原蛋白含量的變化

由表3看出，與正常對(duì)照組比較，博來(lái)霉素刺激后肺組織膠原蛋白含量第3天即開(kāi)始升高(P＜0.05)，第28天達(dá)峰值;肺組織中MPO活性在第3天亦快速升高(P＜0.01)，第14天達(dá)峰值，隨后下降，第28天下降至正常水平。

Tab.3 Bleomycin-induced changes of myeloperoxidase(MPO)activity and collagen level in lung tissue of mice

2.5 博來(lái)霉素刺激后肺組織中PDE4B mRNA表達(dá)的變化

由表4看出，博來(lái)霉素刺激后第14天肺組織中PDE4B mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯增加(P＜0.05)，第28天達(dá)峰值(P＜0.01)。與肺纖維化的發(fā)展趨勢(shì)相符。

Tab.4 Bleomycin-induced changes of phosphodiesterase 4B(PDE4B)mRNA and protein expression in lung tissue of mice

2.6 博來(lái)霉素刺激后肺組織中PDE4B蛋白表達(dá)的變化和分布

PDE4B主要在炎癥細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)。由圖2看出，正常對(duì)照組小鼠肺中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞較少(圖2A);博來(lái)霉素刺激后第3天小鼠肺中表達(dá)PDE4B的炎癥細(xì)胞明顯增多(圖2B)，第7和14天炎癥細(xì)胞進(jìn)一步聚集，并且肺泡上皮細(xì)胞中PDE4B也開(kāi)始表達(dá)(圖2C，D)。隨著纖維化程度加深，這一趨勢(shì)明顯增加。第21和28天肺內(nèi)炎癥細(xì)胞減少，但肺間質(zhì)表達(dá)增加(圖2E，F(xiàn))，提示PDE4B不僅在肺纖維早期的炎癥細(xì)胞表達(dá)，在后期纖維化肺間質(zhì)也有大量表達(dá)。PDE4B蛋白表達(dá)增高的趨勢(shì)與mRNA表達(dá)趨勢(shì)相符。由表4看出，與正常對(duì)照組比較，博來(lái)霉素刺激后第7天PDE4B蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，第28天增加更為明顯 (P＜0.01)。

Fig.2 Changes of PDE4B protein expression induced by bleomycin in lung tissue of mice(Immunostaining).SeeFig.1 for the mouse treatments.A:normal group;B － F:3，7，14，21 and 28 d groups，respectively.?:inflammatory cells;↑:lung interstitial cells.

3 討論

PDE4B是主要的 PDE4形式[6]，存在于人單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，可由脂多糖特異性的誘導(dǎo)表達(dá)[7]，涉及Toll受體信號(hào)、脂多糖誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子的分泌、T細(xì)胞的活化及Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8－10]。博來(lái)霉素誘導(dǎo)的纖維化與特發(fā)性肺纖維化的病理變化相似，是目前應(yīng)用最廣泛的肺纖維化模型，博來(lái)霉素用藥后第14～28天形成肺纖維化[11]。據(jù)報(bào)道，PDE4抑制劑可以減輕博來(lái)霉素導(dǎo)致的肺纖維化[4－5]。但有趣的是羅氟司特可以降低膠原Ⅰ型的轉(zhuǎn)錄，而西洛司特則不能。這是由PDE4抑制劑對(duì)亞型的選擇性差異所致。因此，研究此模型PDE4亞型的表達(dá)有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，博來(lái)霉素刺激后第7天，肺組織內(nèi)聚集大量炎癥細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)少量破壞;第14天肺泡炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集并釋放到肺泡腔，膠原沉積于肺泡間質(zhì)，表明本研究肺纖維化模型制備成功。BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目在博來(lái)霉素刺激后第3天達(dá)到峰值，之后逐漸減少，其中以巨噬細(xì)胞為主。在這個(gè)過(guò)程中，大量的信號(hào)因子被釋放出來(lái)，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的遷移與增殖。本研究顯示多種細(xì)胞因子參與此過(guò)程，IL-1β和IL-6在給藥后第3天達(dá)峰值，TGF-β1在給藥后第7天達(dá)峰值，而MIP-2則呈持續(xù)性增長(zhǎng)。其中IL-1β主要源于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞，是導(dǎo)致纖維化的主要前炎癥因子之一，IL-1β導(dǎo)致肺泡損傷，促進(jìn)間質(zhì)損傷的修復(fù)導(dǎo)致的肺損傷和肺纖維化過(guò)程中有重要作用，參與 MIP-1α 等多種細(xì)胞因子的應(yīng)答[13]。TGF-β1是主要導(dǎo)致纖維化的細(xì)胞因子，可直接作用于成纖維細(xì)胞，主要由巨噬細(xì)胞分泌[14]。而MIP-2與肺纖維化的形成和血管形成有關(guān)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PDE4B表達(dá)在小鼠肺纖維化形成過(guò)程中有逐漸升高的趨勢(shì)。博來(lái)霉素刺激后第14天PDE4B mRNA表達(dá)增加，第28天達(dá)最高值。PDE4B在前期炎癥反應(yīng)中主要在炎癥細(xì)胞中表達(dá)增加，第14天后炎癥細(xì)胞進(jìn)一步聚集，并且肺泡上皮細(xì)胞中PDE4B也開(kāi)始表達(dá)，隨著纖維化程度加深，這一趨勢(shì)明顯增加。在博來(lái)霉素引起的肺纖維化過(guò)程中，PDE4B mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)與肺纖維化程度加深相符，與膠原蛋白沉積和BALF中MIP-2含量的升高等的變化趨勢(shì)一致。由此提示，PDE4B的表達(dá)增加不僅在肺纖維早期炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，在肺纖維化過(guò)程后期也可能扮演著重要角色。

綜上所述，PDE4B在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠纖維化肺組織中高表達(dá)，提示其可能是一個(gè)較好的抗肺纖維化藥物的研究靶點(diǎn)。

[1]King TE Jr，Pardo A，Selman M.Idiopathic pulmonary fibrosis[J].Lancet，2011，378(9807):1949-1961.

[2]Conti M，Beavo J.Biochemistry and physiology of cyclic nucleotide phosphodiesterases:essential components in cyclic nucleotide signaling[J].Annu Rev Biochem，2007，76:481-511.

[3]Spina D. PDE4 inhibitors:current status[J].Br J Pharmacol，2008，155(3):308-315.

[4]Cortijo J，Iranzo A，Milara X，Mata M，Cerdá-Nicolás M，Ruiz-Saurí A，et al.Roflumilast，a phosphodiesterase 4 inhibitor，alleviates bleomycin-induced lung injury[J].Br J Pharmacol，2009，156(3):534-544.

[5]Udalov S，Dumitrascu R，Pullamsetti SS，Al-tamari HM，Weissmann N，Ghofrani HA，et al.Effects of phosphodiesterase 4 inhibition on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J].BMC Pulm Med，2010，10:26.

[6]Wang P，Wu P，Ohleth KM，Egan RW，Billah MM.Phosphodiesterase 4B2 is the predominant phosphodiesterase species and undergoes differential regulation of gene expression in human monocytes and neutrophils[J].Mol Pharmacol，1999，56(1):170-174.

[7]Ma D，Wu P，Egan RW，Billah MM，Wang P.Phosphodiesterase 4B gene transcription is activated by lipopolysaccharide and inhibited by interleukin-10 in human monocytes[J].Mol Pharmacol，1999，55(1):50-57.

[8]Jin SL， Conti M. Induction ofthe cyclic nucleotide phosphodiesterase PDE4B is essential for LPS-activated TNF-alpha responses[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(11):7628-7633.

[9]Jin SL，Goya S，Nakae S，Wang D，Bruss M，Hou C，et al.Phosphodiesterase 4B is essential for T(H)2-cell function and development of airway hyperresponsiveness in allergic asthma[J].J Allergy Clin Immunol，2010，126(6):1252-1259.e12.

[10]Ariga M，Neitzert B，Nakae S，Mottin G，Bertrand C，Pruniaux MP，et al.Nonredundant function of phosphodiesterases 4D and 4B in neutrophil recruitment to the site of inflammation[J].J Immunol，2004，173(12):7531-7538.

[11]Moore BB，Hogaboam CM.Murine models of pulmonary fibrosis[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(2):L152-L160.

[12]Wilson MS，Madala SK，Ramalingam TR，Gochuico BR，Rosas IO，Cheever AW，et al.Bleomycin and IL-1betamediated pulmonary fibrosis is IL-17A dependent[J].J Exp Med，2010，207(3):535-552.

[13]Saito F，Tasaka S，Inoue K，Miyamoto K，Nakano Y，Ogawa Y，et al.Role of interleukin-6 in bleomycin-induced lung inflammatory changes in mice[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2008，38(5):566-571.

[14]Coker RK，Laurent GJ.Pulmonary fibrosis:cytokines in the balance[J].Eur Respir J，1998，11(6):1218-1221.

[15]Keane MP，Belperio JA，Moore TA，Moore BB，Arenberg DA，Smith RE，et al.Neutralization of the CXC chemokine，macrophage inflammatory protein-2，attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].J Immunol，1999，162(9):5511-5518.