董貴俊，王 超，葛新發(fā)，潘衛(wèi)東，李可峰

骨骼肌鈍挫傷是最常見的運動損傷之一，在不同項目運動中均占據(jù)較高的比率［1］，嚴(yán)重影響骨骼肌的收縮功能，破壞肌纖維質(zhì)膜和基底膜的完整性，并最終造成細(xì)胞的死亡，引起骨骼肌的進(jìn)一步損傷［2－4］。在運動醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中，對骨骼肌損傷病理機(jī)制的研究及預(yù)防、治療及康復(fù)措施的探討一直都是熱點。近些年，電磁治療的特殊作用及無創(chuàng)性等優(yōu)點越來越多地受到人們關(guān)注，其研究多數(shù)集中于30～300 Hz 的極低頻電磁場(ELFMFs)。ELFMFs 對生物體不同層次如器官、組織、細(xì)胞、大分子的影響主要表現(xiàn)為非熱效應(yīng)，具體表現(xiàn)為能加快組織愈合、促進(jìn)細(xì)胞分化［5－6］。前人研究中，ELFMFs 通過影響鈣離子通道的活性從而調(diào)控肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵活性，影響肌細(xì)胞中的能量代謝。本研究以骨骼肌鈍挫傷的SD 大鼠模型為實驗對象，通過施加ELFMFs 處理，通過組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、酶學(xué)指標(biāo)檢測等方法來分析電磁場在損傷恢復(fù)過程中的作用，分析ELFMFs 在受損骨骼肌恢復(fù)過程中緩解能量危機(jī)的作用，為運動骨骼肌損傷的治療與康復(fù)提供理論支持。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象及分組

10周齡SPF 級雄性SD 大鼠26 只，由協(xié)和醫(yī)院(北京)實驗動物中心提供，體重260～300 g，分籠正常飼養(yǎng)，自由飲食，給予國家標(biāo)準(zhǔn)混合飼料和自來水，動物房保持適宜的溫度及光照時間(室溫25℃，光照晝夜各12 小時)。

將大鼠隨機(jī)分為正常組、損傷組、假暴露組、磁場暴露組、注射bFGF 組。為了將極低頻磁場的作用效果與目前已經(jīng)取得效果的bFGF 治療進(jìn)行對比，本研究設(shè)注射bFGF 組作為一個陽性對照。

1.2 實驗方法

1.2.1 鈍挫傷模型處理

打擊前，分別在大鼠右下肢的腓腸肌中端標(biāo)記，然后用2%的戊巴比妥鈉(生理鹽水配制)按0.3 ml/100 g 體重的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腹腔麻醉，大鼠處于深度麻醉狀態(tài)后，參照董貴俊等［7］的方法，造成其右側(cè)腓腸肌急性鈍挫傷(圖1)，經(jīng)解剖證實損傷成功率100%。E 組麻醉狀態(tài)下即刻于損傷部位局部一次性皮下注射bFGF溶液0.1 ml(2 μg/ml)。

圖1 打擊器圖示及打擊部位圖

1.2.2 磁場暴露裝置處理

假暴露組大鼠在實驗開始后放置于對照組線圈內(nèi)(每天6 h，10 天，時間09:00－15:00);磁場暴露組在實驗開始后放置于暴露組線圈內(nèi)(每天6 h，10 天，時間09:00－15:00);注射bFGF 組在損傷后即刻于右小腿腓腸肌損傷處局部注射0.1 ml bFGF 溶液(2 μg/ml，生理鹽水配制)，實驗開始后放置于動物房內(nèi)正常飼養(yǎng)10 天;假暴露組、磁場暴露組、注射bFGF 組于實驗開始后第10 天處理結(jié)束后麻醉取材(圖2)。

圖2 自制磁場處理裝置及磁場波形圖

1.2.3 組織、電鏡標(biāo)本制備及觀察

光學(xué)顯微鏡觀察標(biāo)本的制備采用石蠟組織切片技術(shù)。日本OLYMPUS 公司生產(chǎn)的DP70 數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。透射電子顯微鏡標(biāo)本的制作采用超薄切片技術(shù)。通過中國科學(xué)院生物物理研究所生物成像技術(shù)實驗室提供的FEI 生產(chǎn)的Tecnai Spirit 120KV 透射電子顯微鏡及成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

1.2.4 血清提取及檢測指標(biāo)

實驗大鼠腹腔麻醉后，靜脈取血6～10 ml，3 000 rpm、4℃離心兩次，取上層血清分裝于EP 管中，用于測定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)的酶活性，測定試劑盒購自南京建成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均使用SPSS17.0 軟件系統(tǒng)及EXCEL 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較分析采用t 檢驗，多組組間比較采用單因素方差分析;P ＜0.05 為具有差異性，P ＜0.01為顯著差異性，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織病理切片觀察

病理切片(圖3)縱切面顯示，正常組(A)表現(xiàn)為排列緊密而規(guī)律的縱向肌纖維，邊界清晰，細(xì)胞核多且分布于細(xì)胞質(zhì)邊緣，其他組均出現(xiàn)肌纖維排列不緊密、紊亂現(xiàn)象，其中損傷組(C)可見局灶性破壞，損傷處肌纖維完全斷裂，斷面不整齊，損傷嚴(yán)重處因細(xì)胞溶解而邊界模糊;假暴露組(E)肌纖維排列不整齊，可見中央膨大且粗細(xì)不等的梭形肌纖維及大量核內(nèi)移現(xiàn)象;暴露組(G)肌纖維排列較緊密，膜結(jié)構(gòu)界限清晰，核內(nèi)移數(shù)量較少，細(xì)胞粗細(xì)較不均勻;注射bFGF 組(I)細(xì)胞排列較為正常，少量相間的萎縮肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)核內(nèi)移現(xiàn)象。橫切面顯示正常組(B)肌細(xì)胞呈不規(guī)則的卵圓形，且排列緊密，大小均勻(注:不同的細(xì)胞類型染色程度不同);其他組均出現(xiàn)大小不一、形狀變化的細(xì)胞，并且各組有不同程度的炎細(xì)胞浸潤和核內(nèi)移現(xiàn)象;其中損傷組(D)細(xì)胞因組織水腫而間隙明顯，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，邊界模糊，出現(xiàn)膨大的細(xì)胞核;假暴露組(F)細(xì)胞間隙明顯，細(xì)胞為增大、深染的圓形肌細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤;暴露組(H)細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，肌細(xì)胞核增生，少量增大、深染圓形細(xì)胞;注射bFGF 組(J)較為正常，但無法通過染色程度辨別肌細(xì)胞類型。

圖3 SD 大鼠腓腸肌病理切片(HE 染色，×200)

2.2 超微結(jié)構(gòu)變化分析

電子顯微鏡觀察縱切面(圖4)顯示，正常組(A)粗細(xì)肌絲相間平行排列，肌原纖維排列整齊，明暗帶交替出現(xiàn)，Z 線連續(xù)且完整，存在大量位于Z 線附近肌原纖維間的線粒體。其他組均顯示肌小節(jié)不規(guī)則排列，肌原纖維雜亂不齊、模糊不清，線粒體數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)空泡狀線粒體結(jié)構(gòu);損傷組(B)Z 線斷裂、不連續(xù)，出現(xiàn)漂移現(xiàn)象，細(xì)胞膜界限模糊不清;假暴露組(C)Z 線不連續(xù)，細(xì)胞膜界限可以分辨;暴露組(D)Z 線局部不連續(xù)，出現(xiàn)少量空泡化線粒體結(jié)構(gòu);注射bFGF 組(E)肌小節(jié)排列較規(guī)則，但與正常組相比Z 線較細(xì)，且Z 線附近的線粒體數(shù)量明顯減少，且有空泡化線粒體結(jié)構(gòu)。根據(jù)電鏡照片測量肌小節(jié)長度結(jié)果顯示，與正常組相比，C、D、E 組肌小節(jié)長度均明顯縮短(P ＜0.05)，且與假暴露組相比，D、E 組有顯著差異(P ＜0.05)。

圖4 SD 大鼠腓腸肌透射電子顯微鏡切片(×8400)

2.3 血清中CK、LDH、ALP 酶活性測定

2.3.1 血清肌酸激酶(CK)含量

與正常組相比，損傷組、假暴露組有顯著差異性(P ＜0.05)，并且與假暴露組相比，磁場暴露組與注射bFGF 組有顯著差異性(P ＜0.05)(圖5)。

圖5 SD 大鼠血清肌酸激酶(CK) 含量(U/l)

2.3.2 血清乳酸脫氫酶(LDH)含量

與正常組相比，除注射bFGF 組其他各組均有顯著差異(P ＜0.05)，并且與假暴露組相比，磁場暴露組與注射bFGF 組有顯著差異性(P ＜0.05)(圖6)。

圖6 SD 大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH) 含量(U/l)

2.3.3 血清堿性磷酸酶(ALP)含量

與正常組相比，其他組均有顯著差異性(P ＜0.05)，并且與假暴露組相比，磁場暴露組與注射bFGF組有顯著差異性(P ＜0.05)(圖7)。

圖7 SD 大鼠血清堿性磷酸酶(ALP) 含量(U/l)

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究采用重物打擊的方法來模仿運動中骨骼肌受到瞬間爆力沖擊造成的運動損傷來建立SD 大鼠腓腸肌急性鈍挫傷模型［8］。損傷后給予多種不同處理，通過檢測大鼠生化指標(biāo)及特殊病理組織學(xué)的變化評價不同組之間損傷恢復(fù)情況。研究發(fā)現(xiàn)，受損骨骼肌組織切片中膨大的圓形細(xì)胞說明肌細(xì)胞有炎癥反應(yīng)、組織水腫及后期自身修復(fù)的開始，炎性細(xì)胞的浸潤提示存在慢性的炎癥過程，核內(nèi)移現(xiàn)象可能是存在神經(jīng)肌肉接頭功能異常現(xiàn)象;超微結(jié)構(gòu)中肌小節(jié)排列紊亂，Z線飄移，線粒體數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)異常，提示為肌肉損傷處存在能量危機(jī)現(xiàn)象，并且超微結(jié)構(gòu)顯示肌纖維存在損傷現(xiàn)象，肌纖維存在受損后異常收縮現(xiàn)象。ELFMFs能促進(jìn)肌細(xì)胞核增生，使受損傷部位圓形細(xì)胞數(shù)目明顯減少，同時Z 線較自然恢復(fù)組更規(guī)則，減少空泡化線粒體數(shù)量，說明ELFMFs 能減少受損肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)有氧代謝能力恢復(fù)，減緩能量危機(jī)現(xiàn)象。

骨骼肌損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，引起血清中部分酶活性升高［9－10］。隨著肌肉再生及損傷恢復(fù)，血清酶活性逐漸恢復(fù)至正常水平［11－12］。本研究發(fā)現(xiàn)，10天的ELFMFs 處理能有效降低CK 的水平，說明ELFMFs 處理能顯著提高受損肌細(xì)胞細(xì)胞膜的完整性;血清中LDH 及ALP 的顯著降低，說明受損肌細(xì)胞中LDH 及ALP 得到有效保留，從而提高了受損肌細(xì)胞中有氧代謝能力。

3.2 結(jié)論

ELFMFs 能引起鈍挫傷大鼠腓腸肌肌細(xì)胞核增生，顯著改善鈍挫傷后腓腸肌肌小節(jié)長度，改善線粒體空泡化程度，有利于提高鈍挫傷恢復(fù)過程中有氧代謝能力;ELFMFs 處理，能顯著降低鈍挫傷后血清中CK、LDH 及ALP 水平，說明ELFMFs 能顯著改善鈍挫傷后腓腸肌肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，有利于緩解受損肌組織的能量危機(jī)，加速組織恢復(fù)速度。因此，ELFMFs 通過改變鈍挫傷后腓腸肌肌細(xì)胞核增生，加快線粒體自身修復(fù)速度，減少肌細(xì)胞膜的通透性，加速受損肌細(xì)胞有氧代謝能力的恢復(fù)，從而有利于鈍挫傷恢復(fù)。

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