秦 哲， 田慶華， 姚麗芬

癲癇(epilepsy)是中樞神經系統(tǒng)常見慢性疾病，臨床以反復發(fā)作性、短暫性、刻板性的中樞神經系統(tǒng)功能喪失為特征，其電生理表現(xiàn)為腦部神經元過度同步放電，每次發(fā)作稱為癇樣發(fā)作。據(jù)流行病學調查，一般人群的年患病率為是5‰～7‰，活動性癲癇患病率(5年內有發(fā)作)為4.6‰，我國估計難治性癲癇不少于100萬。顳葉癲癇(temporal lobe epilep sy，TLE)是常見的一型藥物難治性癲癇，約占藥物難治性癲癇的60% ～80%左右，通過手術切除致癇灶治療顳葉癲癇可獲得較滿意的療效，其主要病理改變在邊緣系統(tǒng)，尤其是海馬的病變，海馬硬化是顳葉癲癇最常見的病理類型。顳葉癲癇伴海馬硬化者約占顳葉癲癇患者總數(shù)的58% ～60%，其主要病理表現(xiàn)為神經元脫失和膠質細胞增生。通過對癲癇的發(fā)生及發(fā)展機制的研究有利于治療顳葉癲癇，減少患者的痛苦。

本實驗選取顳葉癲癇患者術中切除的海馬組織，用免疫組織化學方法觀察CX32蛋白表達，同時我們對顳葉癲癇患者腦片應用生胃酮及傳統(tǒng)抗癲癇藥物丙戊酸鈉進行處理，用Western-blot方法觀察處理后組織中CX32表達的變化，探討縫隙連接蛋白在癲癇發(fā)病機制中的作用以及生胃酮對縫隙連接蛋白表達的影響，以期對癲癇的干預和控制提供新的視點，尋找開發(fā)抗癲癇新藥的適宜靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 癲癇組海馬標本選自哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經外科手術治療的14例顳葉癲癇患者，該患者均有癲癇發(fā)作的典型表現(xiàn)和腦電圖特征，發(fā)作類型符合國際抗癲癇聯(lián)盟1981年有關癲癇發(fā)作分類的規(guī)定，同時符合以下納入標準:(1)用兩種以上一線抗癲癇藥(卡馬西平、丙戊酸鈉、苯妥英鈉、苯巴比妥)治療，且血藥濃度在有效范圍內，發(fā)作次數(shù)與用藥前比較沒有明顯減少;(2)頭部CT、MRI及相關的實驗室檢查未發(fā)現(xiàn)顱內腫瘤或其它進行性神經系統(tǒng)疾病;(3)術前評估無手術禁忌癥，手術中腦電監(jiān)測有明顯的癇性放電灶，并能進行手術者;(4)患者本人及家屬要求或同意手術治療，術前簽署知情同意書。其中男8例，女6例，年齡11～43歲，平均22.1±6.3歲;病程3～23年，平均9.2±5.5年;近6個月發(fā)作頻率4～36次/m，平均21.3±10.1次/m。對照組8例因其他疾病死亡進行尸檢者相應部位的病變海馬腦組織，死者生前無癲癇發(fā)作。兩組間年齡、性別、發(fā)作時間和切除海馬部位臨床資料比較分析沒有顯著性差異(P ﹥0.05)。

1.1.2 實驗分組 免疫組化實驗部分分組:癲癇組及對照組，兩組標本選取同上。Western-blot實驗部分分組:共分4組:癲癇組、癲癇+生胃酮組、癲癇+丙戊酸鈉組、對照組。

1.2 實驗方法

1.2.1 普通免疫組織化學染色方法(辣根過氧化物酶法)

1.2.1.1 標本收集和保存 術中切除海馬組織術中取出后，按解剖分區(qū)法，選取含齒狀回區(qū)的海馬亞區(qū)待用，免疫組化和HE染色標本置于4%多聚甲醛和15%的苦味酸中室溫下過夜，再移入含25%蔗糖的PBS中，4℃浸泡至組織塊沉底，隨后常規(guī)石蠟包埋切片，常溫保存?zhèn)溆?對照組標本處理同上。

1.2.1.2 實驗方法 切片前準備:(1)切片、撈片。撈出后的片子，放于56℃臺上晾干。(2)鼓風干燥箱干燥＞15min后取出，放置過夜。步驟:(1)烤片1h;(2)二甲苯脫蠟(3個，各20min);(3)酒精水化;(4)自來水沖3遍(注意:自來水淋到載破片邊緣以免組織被沖掉)后蒸餾水涮洗3遍;(5)H2O210min，消除內源性過氧化氫酶活性;(6)自來水沖3遍，蒸餾水沖3遍，PBS泡2～3min;(7)高壓修復:待水沸騰后放入盛有枸櫞酸(pH值=6.0)的高壓鍋，蓋蓋，大小浮子閥跳起后放上安全閥，160度，等安全閥旋轉冒氣后，換擋到120度，計時間2min30s，關開關，拔電源，自然冷卻。自來水沖3遍，蒸餾水沖3遍;(8)曲拉通溶液10min;(9)PBS沖洗后，用力甩干，畫道，滴加一抗(濃度為1:50)于切片，放入恒溫箱1h;(10)取出后自來水沖3遍，PBS沖3遍，用力甩干;(11)滴加二抗(濃度為1:100)，恒溫箱 30min，水沖，PBS沖;(12)帶手套，加DAB顯色液(1ml蒸餾水加試劑個一滴，按試劑順序，A、B、C滴加)，光鏡下觀察，水沖，沖洗要充分;(13)蘇木素復染3min;(14)1%鹽酸酒精分化一下，自來水(熱)返藍;(15)酒精脫水;(16)中性樹膠封片。

1.2.1.3 免疫組化結果判定方法及統(tǒng)計分析

在不知背景資料的情形下，采用雙盲法進行。各腦組織切片均在同一水平，每隔3張切取1張，各組織均取6張，每張切片數(shù)5個視野陽性著色細胞，然后取其平均值。對照組選取斷面水平相似的組織切片。所有切片在同一強度同一放大倍數(shù)下進行。實驗數(shù)據(jù)均用χ±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為有差異。統(tǒng)計學分析用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行。

1.2.2 Western-blot分析

1.2.2.1 腦片制備 (1)癲癇患者海馬組織術中取出后，迅速放入冰冷蔗糖腦脊液中，腦脊液通入95%O2～5%CO2的混合氣體，配置后的腦脊液其調節(jié)滲透壓應為300～315mOsm，pH值為7.4;(2)用組織膠將海馬組織固定于震動切片機支架上，幾秒鐘后待組織完全固定，將其浸于震動切片機內冰冷的ACSF中。切片時推進速度范圍為0.14～2mm/s，盡量選低速前進，減少刀片對組織的擠壓損傷，震動頻率范圍為60～4500r/min，一般用3500r/min，先棄掉組織上端的不規(guī)則部分。(3)選取海馬齒狀回位置，以400um間隔在蔗糖腦脊液中沿海馬水平位切海馬腦片，每片400um。切下的腦片用軟毛筆移至冰盒中的含氧冰冷ACSF的多孔培養(yǎng)皿中。(4)將所選腦片移至3個培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿溶液換蔗糖腦脊液，持續(xù)通入95%O2～5%CO2的混合氣體，1號培養(yǎng)皿加0.3mol/L mVPA，2號培養(yǎng)皿加200μmol/L Carb，3號培養(yǎng)皿不給予加藥，4號培養(yǎng)皿內放正常對照腦片。(5)9h于4個培養(yǎng)皿各取出若干腦片，分別擇取1～2片觀察細胞形態(tài)，同時進行電流膜片鉗紀錄，以證實腦片存活。腦片置于-80℃冰箱保存行Western-blot實驗。

1.2.2.2 Western-blot實驗 (1)蛋白提取 ①取凍存裂解液一管(990ul)加10mlPMSF，搖晃混勻，與術中所取海馬組織放在一起，放入冰盒內，冰盒置于冰上，樣品從冰盒中取出融化后應用0.9%NaCl小心洗脫培養(yǎng)液顏色，將NaCl輕輕吸除干凈，每管加入混勻后裂解液100ul，每個樣品標記好后將1mlEP管放入4℃冰箱裂解1.5h左右;②取出樣品與高速冰凍離心機中，4℃ 1000r離心10min，取上清液;③樣品蛋白含量測定;(2)電泳:①配10%過硫酸銨1ml;配液1+1ml去離子水過硫酸銨;配液1×電泳液+900ml去離子水;配液1×轉膜液+100ml儲存液+200甲醇+700ml去離子水;②配10%分離膠5ml鋪膠。配膠前裝好膠板，架子上固定，盡可能使膠板與橡膠條接觸緊密，TEMED加入后將膠吹打均勻，緩慢加入到膠板中間，加入量大致到距離薄膠板上邊緣0.6～0.8cm處，加水封，凝膠時間大約在20～30min，看膠與水封間的印痕出現(xiàn);③配積層膠2ml，再加分離膠鋪好20～30min左右，膠與水封印痕出現(xiàn)時配制積層膠;④去梳子，上裝電泳槽。積層膠完全凝好后，去梳子將膠與板與電泳配板按正確的方法卡到電路板上，對準后放入內槽卡好。將槽內卡入外槽中，內槽加電泳液至槽膠板上緣齊平，以檢查是否漏液;⑤上樣，按50μg蛋白量上樣，即對照組為 8μl，顳葉癲癇組為 11μl，marker每孔加2ml;⑥電泳，在外槽加入電泳液，液面低于內槽2～5cm，積層膠電泳加70V恒壓，約20min左右;分離膠電泳加110V恒壓，約30min左右;(3)①轉膜，將轉膜板打開，分開海棉，濾紙用玻璃棒輕輕壓好，然后將膜覆于膠上，同樣用玻璃棒趕壓去氣泡，將上層濾紙覆蓋好，趕壓氣泡，扣好轉膜板放入轉膜槽。電壓150V，約70min左右;②洗膜:轉膜結束后用鑷子取出膜放入盛有PBS-T的自制塑料小槽中，置于TS-1000、ORB2AL、SHAKER 上振蕩洗膜 3次，90轉/min，每次6min;③雜交一抗 將抗體于 Primary Antibody Dilution Buffer中稀釋，比例為1:1000。將膜從Blocking Buffer取出，放于一抗液中，室溫孵育1h;④洗膜一抗雜交完畢后，吸出抗體液，按前方法洗膜3次;⑤雜交二抗 將膜取出放于1×TBS中孵育30min，每5min換一次液體。將膜置于二抗中，稀釋比例為1:1000，室溫孵育1h;⑥顯色 將膜從二抗中取出，放于1×TBS中孵育30min，用濾紙吸干液體;⑦洗膜雜交完畢，吸出二抗，先用PBS-T洗二遍，6min/次，然后用 PBS洗 3遍，6min/次;⑧顯色使用ECL顯色劑顯色，洗片。膠片經透射掃描儀掃描后獲得圖像。

1.2.2.3 Western-blot結果判定及統(tǒng)計學分析

Western-blot檢測結果膠片經透射掃描儀掃描后獲得圖像，應用Image-pro-plus圖像分析系統(tǒng)對圖片進行半定量研究，測定待測蛋白與內參照蛋白的灰度值，兩組間比值進行比較。所測數(shù)據(jù)用χ±s表示，統(tǒng)計學分析采用SPSS11.0軟件進行;多樣本間均數(shù)比較采用One-way ANOVA檢驗，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果

在癲癇組和對照組海馬組織中均可以檢測到縫隙連接蛋白Cx32陽性細胞，且主要在神經元胞體及軸突均有表達，胞漿或胞膜內可見褐色顆粒表達，對照組表達弱。癲癇組表達量較對照組增強。經統(tǒng)計學處理，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見表1、圖 1)。

表1 Cx32免疫組化染色結果(χ±s)

2.2 Western-blot結果

癲癇組與癲癇+丙戊酸鈉組縫隙連接蛋白Cx32的表達明顯增高，兩者之間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，癲癇組、癲癇+丙戊酸鈉組兩組較癲癇+生胃酮組、對照組縫隙連接蛋白Cx32的表達明顯增高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而對照組與癲癇+生胃酮組兩組縫隙連接蛋白CX32的表達無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)(見表2)。

圖1 免疫組化結果(×400)

表2 Cx32海馬Western-blot檢測結果 (IOD)(χ±s)

3 討論

縫隙連接(gap junction，GJ)作為細胞膜上的一種特殊結構，小分子物質及一些信息離子經該通道進行細胞間的轉運，是相鄰細胞間的通訊通道，縫隙連接參與了細胞間電信號傳遞的電耦聯(lián)和物質交換的代謝耦聯(lián)，對細胞的新陳代謝、、增殖和分化、內環(huán)境穩(wěn)定等生理過程有一定的調控作用。同時它還參與整合膠質細胞的活動和傳遞第二信使，另外，縫隙連接允許離子如鉀離子、鈉離子、一些其他小分子物質及鈣離子等通過而直接進行物質信息交換。故在神經元快速同步化、神經元電活動的維持、神經元的發(fā)育中起到重要的作用，由于縫隙連接是電突觸的結構基礎，縫隙連接促使相鄰細胞之間形成同步化活動造成異常放電在癲癇的發(fā)生和發(fā)展中起到一定的作用。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇患者海馬中神經元脫失，數(shù)量明顯減少，考慮在癲癇發(fā)生早期，由于縫隙連接蛋白表達增多，增加了電耦聯(lián)及代謝耦聯(lián)，并且促進小分子物質的信號傳遞，促進細胞凋亡，故而縫隙連接蛋白有損傷作用。在中樞神經系統(tǒng)內縫隙連接蛋白起到非常重要的作用，這些作用已經被大量的研究所證實。中樞神經系統(tǒng)內的神經元之間的縫隙連接在信號傳遞等方面起到相當重要的作用。如Ca2+、三磷酸肌醇(IP3)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)等小信號分子可以通過胞膜上的縫隙連接在相鄰的兩個細胞之間互相傳遞。有研究表明，通過縫隙連接IP3可以誘導細胞凋亡。Szalai等1報道，在細胞受到生長因素剝奪、缺氧等促凋亡因素刺激下，IP3與位于內質網上的IP3受體結合并且能都大量的產生，內質網內的大量的Ca2+釋放到線粒體，使線粒體滲透性孔開放，導致大量釋放細胞色素C，caspase激活，最終導致細胞凋亡。另外有觀點認為，IP3能夠對線粒體細胞色素C的釋放起放大作用。細胞色素C從線粒體開放的滲透性孔大量釋放后，與IP3受體結合，從而阻止了IP3受體抑制鈣的作用，最終促進了Ca2+依賴性的凋亡，從而形成惡性循環(huán)。然而這種促凋亡的作用在給予縫隙連接阻滯劑后就會消失不見。另外縫隙連接蛋白有促進同步化放電的功能，在海馬中同時存在很多的興奮傳入纖維和傳出纖維，這些興奮性纖維的存在極容易產生同步化放電，Nikolaus等2對正常的野生型大鼠與Cx36基因剔除大鼠做對比研究，發(fā)現(xiàn)在剔除Cx36基因的海馬腦片中，測得由4-氮基吡啶引起的癲癇放電減少，而且高頻震蕩的頻率明顯降低，而在給予持續(xù)的強直刺激下，正常的海馬腦片中能夠引起高頻震蕩。由此可見，海馬內Cx36能夠促進同步化放電發(fā)生。少突膠質細胞中縫隙連接的主要作用是營養(yǎng)髓鞘，同時具有促進凋亡的作用。在少突膠質細胞Cx32是最早被檢測出來的連接蛋白，它在華勒變性和髓鞘發(fā)育、軸突再生時表達。有研究發(fā)現(xiàn)，在剔除Cx32的轉基因大鼠中發(fā)現(xiàn)其神經傳導速度也會明顯下降，髓鞘很稀疏?？p隙連接在細胞凋亡過程中究竟是起到促進作用還是抑制作用仍存在很多爭議。在有些研究中發(fā)現(xiàn)，縫隙連接可以通過“旁觀者效應”來誘導細胞凋亡。Udawatte等3的研究發(fā)現(xiàn)，在凋亡細胞培養(yǎng)基中，應用細胞色素C來誘導細胞凋亡，(細胞色素C一種線粒體衍生的凋亡蛋白)，將通過Cx32相耦聯(lián)的兩細胞中的一個細胞放在含有細胞色素C的磷酸鹽緩沖液中孵育2h，然后將另一個細胞放在同一個培養(yǎng)基中，TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，雖然細胞色素C不能夠通過縫隙連接，但卻能夠使相鄰的細胞也發(fā)生凋亡，而且應用縫隙連接阻滯劑能夠明顯阻斷這種誘發(fā)相鄰細胞凋亡的效應。甲碘荷包牡丹堿(bicuculline methiodide，BMI)為γ-氨基丁酸A型受體(GABAA)的拮抗劑，Samoilova等4將BMI處理海馬CA1區(qū)的錐體細胞層，細胞外記錄方法發(fā)現(xiàn)癲癇樣放電，結果可見細胞膜的Cx32 mRNA和Cx43 mRNA的表達增高，縫隙連接起促進癲癇的形成作用。我們試驗發(fā)現(xiàn)主要在神經元表達的Cx32的表達也是增加的，這種增加時在神經元大量減少的情況下發(fā)生的，那么可見單個神經元中的Cx32的表達是很強的，這種長期癲癇形勢下出現(xiàn)的Cx32的表達略增多，增加了神經元之間的電突觸傳遞，促進神經元的同步電活動。

本實驗顯示難治性癲癇患者海馬中Cx32蛋白的表達量增多，星形膠質細胞增生，神經元減少?？p隙連接蛋Cx32的表達有實驗結果表明為減少。與我們的實驗結果不完全一致，考慮為反復癇性損傷因素的存在，最終導致神經元大量的死亡和脫失，神經元的數(shù)量和功能發(fā)生了變化，主要在神經元表達的Cx32的表達量也隨之可能減少，但仍有待證實。另外有研究發(fā)現(xiàn)構成星形膠質細胞之間的縫隙連接蛋白CX43 mRNA表達明顯升高，而構成神經元之間的縫隙連接蛋白CX32 mRNA的變化不明顯?？紤]可能的原因是癲癇發(fā)生部位的腦組織神經元過度同步化放電，使釋放到細胞外的K+增加，星形膠質細胞為了清除過多的K+，使CX43 mRNA表達代償性的增加，星形膠質細胞之間的縫隙連接數(shù)目增加，使清除K+的面積增加。有利于維持神經元的正常的微環(huán)境。Cx32的表達增高促進了神經元縫隙連接的形成，間接的增加了新的電突觸數(shù)目并增強了電傳導性，導致神經元同步化放電擴大。故神經元中表達最多的Cx32以及在星形膠質細胞中表達最多的Cx43可能在促進神經元的同步放電并導致癲癇持續(xù)發(fā)生中起到主要作用。

另外，本實驗發(fā)現(xiàn)給予生胃酮干預后Cx32的表達明顯減少，與對照組相比較無明顯差異，而傳統(tǒng)抗癲癇藥物丙戊酸鈉的干預卻無明顯影響。生胃酮是一種甘草酸的合成衍生物，臨床用來治療胃潰瘍。有學者發(fā)現(xiàn)生胃酮能很好地抑制癇樣放電及癇性發(fā)作。Velazquez等5應用原位末端標記技術(the method of TclT mediated dUTP2biotin nick end labeling，TUNEL)染色的方法，用縫隙連接阻滯劑甘珀酸作用于腦部短暫性缺血的大鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)與未注射GJ阻滯劑甘珀酸的大鼠相比，其陽性細胞數(shù)明顯減少，說明應用縫隙連接阻滯劑具有一定的減輕腦損傷的作用。Ross等6觀察大鼠海馬腦片發(fā)現(xiàn)，生胃酮會延長癇樣放電潛伏期，減輕癇樣放電程度。我們推測生胃酮可能阻斷了縫隙連接耦連和降低了Cx32的合成，從而抑制了由縫隙連接導致的損傷傳遞，降低了癲癇的發(fā)作程度，具有明顯的保護作用。而丙戊酸鈉并不影響Cx32的表達，可見傳統(tǒng)抗癲癇藥物丙戊酸鈉的抗癲癇機制與縫隙連接無關，縫隙連接具有獨立于傳統(tǒng)化學性突觸的致癇機制。這與既往研究所標明的縫隙連接是傳統(tǒng)化學性突出的補充，而不是替代結構相一致。

4 結論

縫隙連接蛋白Cx32蛋白在難治性顳葉癲癇患者海馬腦組織中表達明顯增強。Cx32的表達增高促進了神經元縫隙連接的形成，間接的增加了新的電突觸數(shù)目并增強了電傳導性，導致神經元同步化放電擴大。故神經元中表達最多的Cx32可能在促進神經元的同步放電并導致癲癇持續(xù)發(fā)生中起到主要作用。

給予生胃酮可以明顯抑制CX32的表達，應用丙戊酸鈉并不能對縫隙連接的表達產生影響，說明傳統(tǒng)抗癲癇藥物丙戊酸鈉的抗癲癇機制與縫隙連接無關，縫隙連接具有獨立于傳統(tǒng)化學性突觸的致癇機制，開發(fā)作用于縫隙連接通道的藥物有可能成為治療癲癇的新方法。

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