吳二兵， 陳 鑫， 張元媛， 施建生， 高志偉

氧化應(yīng)激在PD的發(fā)病機制中占有十分重要的地位，很多環(huán)節(jié)最后都通過氧化應(yīng)激這一共同通路起作用，因此，針對PD抗氧化治療的研究越來越多［1，2］。本研究探討依達拉奉對6-羥基多巴(6-OHDA)誘導的帕金森病大鼠模型黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量的影響和神經(jīng)元保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD大鼠，體重250～300g，由南通大學實驗動物中心提供。標準環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和藥品 6-OHDA、抗壞血酸、阿樸嗎啡(apomophine，APO)、抗TH抗體、戊巴比妥鈉、DAB(Sigma公司，美國)，SABC試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，依達拉奉(Edaravone，ED，必存)(南京先聲東元制藥有限公司)，MDA試劑盒(南京建成科技有限公司)NO試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.3 主要儀器 MICRO4型動物腦立體定位儀(WPI公司，美國)，5μl微量進樣器(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)，EL303電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，CM1900冰凍切片機(LAICA，德國)，BX50WI倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.4 動物分組 將實驗動物分為神經(jīng)生化學和組織學兩組，各組分為:(1)正常對照組(n=6);(2)NS對照組(n=6);(3)依達拉奉組(n=24)，依達拉奉又分為0.3mg/kg 14d 組(n=6)，1mg/kg 14d 組(n=6)，3mg/kg 14d組(n=6)及3mg/kg 28d組(n=6)4個亞組。

1.5 模型的制備 模型組大鼠用復(fù)合麻醉劑(0.25ml/100g體重)腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回縮反射及角膜反射消失后，將其頭部水平位固定在腦立體定位儀上(美國WPI公司)，剪除顱頂鼠毛，碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開一長約2cm切口，充分暴露前囟，參照Paxinos and Watson(1996)《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束(MFB)三維坐標位置，選取mfb區(qū)坐標:前囟后2.8mm，中線左側(cè)2.0mm，硬膜下8.2mm。根據(jù)注射位點確定鉆顱部位，手術(shù)刀尖小心鉆開一直徑約2mm顱骨孔，微量進樣器緩慢進針至靶點，留針10min，以9ng/s的速度注入2μg/μl 6-OHDA 4μl(含0.02%抗壞血酸)，注射完畢后留針 10min，以1mm/min的速度退針。手術(shù)完畢，用明膠海綿堵塞顱骨孔，適量青霉素涂敷創(chuàng)口，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。并于2w、4w后分別檢測大鼠行為學和組織學的改變。假手術(shù)組同法予含0.02%抗壞血酸的生理鹽水4μl，正常組不作任何處理。正常對照組不進行任何處理，其余5組均在大鼠MFB注射6-OHDA，方法同第一部分，術(shù)后30min即分別腹腔注射NS 1ml、依達拉奉0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg，每天兩次，連續(xù)應(yīng)用 14d，其中3mg/kg 28d組大鼠在最末一次用藥后繼續(xù)飼養(yǎng)至術(shù)后28d。

1.6 旋轉(zhuǎn)試驗 實驗大鼠在最后一次用藥后，腹腔注射AP0誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為。APO誘導旋轉(zhuǎn)試驗:模型組分別于術(shù)后2w、4w于動物腹腔內(nèi)注射APO 0.5mg/kg誘發(fā)大鼠以健側(cè)后肢為支點，向右側(cè)(健側(cè))旋轉(zhuǎn)，于APO注射后5min開始記錄，共記錄30min。以2w、4w誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于210次/30min為合格模型。

1.7 組織學方法 各組大鼠在行為學檢測后，用復(fù)合麻醉劑將大鼠深度麻醉，快速灌注生理鹽水(37℃)150～200ml沖洗。隨即灌注4%甲醛(4℃)先快速灌注200ml，再緩慢灌注300ml。然后斷頭取腦，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸鹽緩沖液內(nèi)4℃冰箱至腦塊沉入瓶底。取紋狀體及中腦組織塊進行冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚20μm。切片作尼氏體染色;高倍鏡下計數(shù)各組標本兩側(cè)黑質(zhì)致密部(SNc)的尼氏體陽性細胞數(shù)，取每組黑質(zhì)區(qū)的冠狀切片各10張，每張切片連續(xù)計數(shù)3個互不重疊高倍視野內(nèi)陽性細胞數(shù)，求其平均值。

1.8 神經(jīng)生化學檢測 實驗大鼠在最后一次用藥后次日，快速斷頭，迅速取出大腦，在冰臺上分離出紋狀體和中腦黑質(zhì)，用4℃生理鹽水沖洗除去血液，在干冰上用濾紙拭干，立即置于-80℃超低溫冰箱。待樣本收齊后，稱重并用眼科小剪剪碎組織塊，置于冰浴的玻璃勻漿器中充分勻漿，按照試劑盒操作要求，用酶標儀檢測各組大鼠兩側(cè)紋狀體和黑質(zhì)部MDA、NO活性的變化。

1.9 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)資料表達采用χ±s表示。用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 依達拉奉對大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響 除空白對照組APO未誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)外，其余各組均出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)(＞210次/min)，統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.01);ED 3mg/kg 14d、28d 組較 NS、ED 0.3mg/kg 和 ED 1mg/kg組旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);ED 3mg/kg組大鼠14d后出現(xiàn)隨意爬行行為，NS、ED 0.3mg/kg和ED 1mg/kg組無此行為改變(見表1)。

2.2 依達拉奉對大鼠黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細胞數(shù)的影響 高倍鏡下可見NS和ED組大鼠左側(cè)Cpu(尾狀核)和SNc(黑質(zhì)紋狀體致密部)神經(jīng)細胞均有不同程度的損傷，NS和ED組左側(cè)SNc尼氏體陽性細胞較對照組減少(P＜0.05)，NS和ED組左側(cè)SNc尼氏體陽性細胞比右側(cè)減少(P＜0.05);ED 3mg/kg 14d、28d組左側(cè) SNc尼氏體陽性細胞較 NS、ED 0.3mg/kg和ED1mg/kg組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，14d、28d兩組間結(jié)果無統(tǒng)計學差異(見表2、圖1)。

2.3 依達拉奉對NO含量的影響 ED3mg/kg組黑質(zhì)紋狀體NO含量較NS、ED0.3mg/kg和ED1mg/kg組減少(P＜0.05)，ED3mg/kg 14d組與28d組間比較無統(tǒng)計學差異(見表3)。

2.4 依達拉奉對MDA含量的影響 ED 3mg/kg組黑質(zhì)紋狀體MDA含量較NS、ED 0.3mg/kg和ED 1mg/kg組減少(P ＜0.05)，ED 3mg/kg 14d組與28d組間比較無統(tǒng)計學差異(見表4)。

表1 依達拉奉對大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響(次/30min)(χ±s)

表2 依達拉奉對大鼠黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細胞數(shù)的影響(個/高倍視野)(χ±s)

表3 依達拉奉對大鼠左側(cè)黑質(zhì)紋狀體NO含量的影響(μmol/gprot)(χ±s)

表4 依達拉奉對大鼠左側(cè)黑質(zhì)紋狀體MDA含量的影響(nmol/mgprot)(χ±s)

3 討論

氧化應(yīng)激是由于過多的氧自由基和過氧化合物超過了機體自身的抗氧化能力，引起細胞膜脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng)和膜的流動性改變而破壞細胞的過程。任何進行需氧代謝的細胞都處于氧化應(yīng)激狀態(tài)中，隨著機體的老齡化，抗氧化能力不斷下降，最終導致機體重要結(jié)構(gòu)和功能分子的氧化損傷。多巴胺(DA)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的DA可被單胺氧化酶B(MAO-B)所降解，生成H2O2、醌、半醌和氨，在正常黑質(zhì)高水平鐵存在的條件下，H2O2通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生毒性更強的羥自由基，影響多種細胞內(nèi)成分(如酶、轉(zhuǎn)運體、蛋白、脂肪酸及DNA等)的功能，攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而導致細胞器裂解、DA神經(jīng)元死亡。DA自氧化產(chǎn)生的高活性分子，作用于細胞成分后被吸收或形成更多的ROS，形成惡性循環(huán)。

應(yīng)用左旋多巴仍是治療PD最重要的方法之一，但其僅僅是對癥治療，不能從根本上防治PD及延緩病情的進展，長期用藥后療效減退，可出現(xiàn)運動波動、異動癥和精神癥狀。因此，新的治療策略提出神經(jīng)保護治療，以減緩甚至阻止神經(jīng)元變性的進展。依達拉奉的主要成分為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，通過轉(zhuǎn)移一個電子給自由基而產(chǎn)生MCI-186基團從而打斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈來保護神經(jīng)細胞;也能防止由花生四烯酸的代謝中間體脂質(zhì)過氧化物15-HPETE引起的氧化性細胞損害，抑制神經(jīng)元死亡;還能防止血管內(nèi)皮細胞損傷，保護線粒體功能，發(fā)揮有益的抗自由基損傷作用［3］。依達拉奉具有親脂基團，其血腦屏障穿透率約為60%，靜脈給藥之后可以清除大腦內(nèi)的具有高度細胞毒性的羥自由基，抑制腦細胞血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞的過氧化作用，減少缺血半暗帶發(fā)展成梗死的體積，延遲神經(jīng)細胞死亡，減輕腦缺血以及腦缺血引起的腦水腫和組織損傷。

吳冠會等［4］用γ放射性計數(shù)儀測定6-OHDA誘導的PD大鼠雙側(cè)紋狀體、大腦皮質(zhì)、小腦多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transporter，DAT)的含量，結(jié)果顯示，大劑量依達拉奉腹腔注射能阻止損傷側(cè)的DAT放射性計數(shù)的減少，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，提示依達拉奉能增強組織的抗氧化能力。

本研究除空白對照組APO未誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)外，其余各組均出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)(＞210次/min)，統(tǒng)計學差異顯著(P ＜0.01);ED 3mg/kg 14d、28d 組較 NS、ED0.3mg/kg和ED1mg/kg組旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。依達拉奉(3mg/kg)能夠減少APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，且對大鼠自發(fā)的行為變化也有改善作用。實驗發(fā)現(xiàn)，3mg/kg組大鼠在治療14d時雖然動作緩慢，但能隨意爬行，其他治療組大鼠無此改變，仍向損傷側(cè)自發(fā)緩慢旋轉(zhuǎn)或少動，對此目前國內(nèi)外尚未見報道。這一結(jié)果可能與依達拉奉阻止了自由基對DA神經(jīng)元的損傷，減少DA的丟失，從而延緩或阻止病情的進一步發(fā)展，提示依達拉奉可改善6-OHDA誘導的PD大鼠行為學變化。

一氧化氮(NO)是一種重要的生物信使分子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中參與調(diào)節(jié)一系列生理過程，如神經(jīng)突觸的發(fā)生以及腦血流量的調(diào)節(jié)等。但過量的NO則表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用，介導神經(jīng)變性的病理過程。

(iNOS)［5］編碼 NOS 的基因(NOS1，NOS2A，and NOS3)可能會引起NO過剩，從而促成PD的神經(jīng)元變性發(fā)生。Carbone 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和干擾素(INF-γ)能激活初原星型膠質(zhì)細胞，選擇性誘導NOS1 mRNA及其蛋白，增加NO的生成，并顯著提高球蛋白的硝基化。Hancok等［7］研究認為，NOS1和NOS2A可作為PD的基因危險因子，并可與已知的環(huán)境因子相互作用而調(diào)制環(huán)境效應(yīng)。MPTP可使酪氨酸羥化酶硝基化而失活，導致神經(jīng)元中DA水平下降。研究發(fā)現(xiàn)［8］，與野生鼠相比，nNOS基因敲除的小鼠對MPTP的毒性有抵抗力，提示NO可能使DA能神經(jīng)元易損性增加。NO主要通過過氧化亞硝基陰離子(ONOO-)發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，NO與超氧陰離子(O2

圖1 依達拉奉對各組大鼠左側(cè)黑質(zhì)NISSL小體的影響(×400)

-)相互作用形成ONOO-，后者是一種極其活躍的強氧化劑，它不僅自身有細胞損傷作用，還可與H+形成ONOOH，并迅速分解成許多毒性代謝產(chǎn)物如·OH、NO2-和NO3-等，而毒性更強的·OH則進一步對細胞產(chǎn)生損傷作用。此外，NO還可通過抑制線粒體呼吸鏈的功能和介導谷氨酸興奮性毒性作用而使神經(jīng)細胞損傷。

6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)紋狀體后，可多種氧化應(yīng)激產(chǎn)物形成，如MDA、NO等，它們可進一步對神經(jīng)細胞發(fā)揮損傷作用。MDA是生物膜中的多不飽和脂肪酸受到氧自由基攻擊后，形成的一種脂質(zhì)過氧化物。在PD中，隨谷光甘肽(GSH)含量下降，神經(jīng)元清除自由基能力降低，引起黑質(zhì)脂質(zhì)過氧化增強，其產(chǎn)物MDA增加，同時游離鐵又參與DA的自身氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致自由基增多，從而損傷黑質(zhì)神經(jīng)元。NO是一種重要的生物信使分子，參與調(diào)節(jié)一系列生理過程。

本實驗結(jié)果顯示，6-OHDA導致MDA、NO含量增加(P＜0.05)，依達拉奉3mg/kg可阻止此增加，而依達拉奉0.3mg/kg和1mg/kg對此變化影響不顯著，表明依達拉奉對PD大鼠的保護作用呈劑量依賴性，這種作用主要可能與其抑制自由基的活性有關(guān)。為觀察依達拉奉對DA神經(jīng)元的遠期保護作用，本實驗檢測了依達拉奉停藥后14d大鼠行為學、形態(tài)學及神經(jīng)生化方面的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此時其對6-OHDA導致的黑質(zhì)紋狀體損傷的保護作用與治療4d時效果相當，說明依達拉奉對神經(jīng)元損傷后較遠期仍有保護作用。本實驗結(jié)果顯示，依達拉奉(3mg/kg)阻止了6-OHDA損傷后黑質(zhì)尼氏體陽性細胞減少，表明依達拉奉可能通過抑制自由基的損傷對6-OHDA損傷后黑質(zhì)的神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用，且呈劑量依賴性。

雖然目前PD的確切發(fā)病機制尚不清楚，但氧化應(yīng)激機制參與了6-OHDA導致的大鼠黑質(zhì)紋狀體的損傷。本實驗結(jié)果顯示，大劑量的依達拉奉通過減少6-OHDA大鼠黑質(zhì)和紋狀體中MDA、NO含量而對神經(jīng)元起保護作用，目前國內(nèi)外尚未見類似報道。

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