趙麗紅， 林立文， 張顏波

低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxic preconditioning，HP)是一種機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，其通過(guò)一系列復(fù)雜環(huán)節(jié)調(diào)動(dòng)機(jī)體潛能減輕缺氧損傷，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。腦梗死是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，容易造成智能障礙和肢體殘疾等癥狀，但缺乏特異性臨床治療方法或藥物。如何將HP保護(hù)理論應(yīng)用于臨床疾病的治療是目前國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。我們既往實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步證實(shí)，低氧預(yù)適應(yīng)能改善急性腦梗死小鼠神經(jīng)功能評(píng)分，減少急性腦梗死面積［1～10］。急性腦梗死缺血半暗帶神經(jīng)元功能的恢復(fù)，是提高患者預(yù)后的關(guān)鍵。Bcl-2、Bax和Caspase-3是神經(jīng)元凋亡重要調(diào)節(jié)因子，故本實(shí)驗(yàn)擬觀察低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)急性腦梗死小鼠缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡的影響，應(yīng)用激光共聚焦、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡因子，探索相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 立體定位儀(51600型，美國(guó) Stoelting公司)、冰凍切片機(jī)(LEICA CM1900型，瑞士徠卡公司)、激光共聚焦顯微鏡(Radiance 2100型，美國(guó) Bio-Red公司)、恒溫培育箱(WGP-350，上海安亭科學(xué)儀器廠)、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司)、PBS(武漢博士德公司)、SABC-FITC免疫熒光檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司)、兔抗鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3抗體、羊抗兔多克隆二抗(SANTA CRUZ公司)、玫瑰紅(美國(guó)Sigma公司)、冷光源 (LG-150型，徐州恒達(dá)光學(xué)電子儀器有限公司)、0.01mol/L PBS、多聚甲醛(SANTA CRUZ公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Balb/c近交系小鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，雌雄不拘，由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。數(shù)字隨機(jī)表法分為4組:(1)正常對(duì)照組(N)，無(wú)任何處理;(2)假手術(shù)組(C)，僅行冷光源照射，不注射玫瑰紅;(3)急性腦梗死組(CI)，光化學(xué)法誘導(dǎo)小鼠腦皮質(zhì)梗死模型;(4)低氧預(yù)適應(yīng)+急性腦梗死組(HP+CI)，低氧預(yù)適應(yīng)后復(fù)制光化學(xué)法誘導(dǎo)小鼠腦皮質(zhì)梗死模型，每組小鼠12只，共48只。

1.3 低氧預(yù)適應(yīng)模型的復(fù)制［1～10］將低氧對(duì)照組、低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠放入一個(gè)125ml的廣口瓶?jī)?nèi)，立即用橡皮塞封緊，以動(dòng)物出現(xiàn)第1次喘呼吸為低氧耐受極限的標(biāo)志，完成低氧暴露1次(H1);隨即再將低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠移入新的廣口瓶?jī)?nèi)、封閉，依此再重復(fù)操作3次(H4)，復(fù)制低氧預(yù)適應(yīng)模型。正常對(duì)照組小鼠不進(jìn)行低氧暴露。

1.4 光化學(xué)誘導(dǎo)小鼠腦皮質(zhì)急性腦梗死模型的制作［4］室溫 25℃條件下，腹腔注射水合氯醛0.35g/kg麻醉，經(jīng)尾靜脈緩慢注入100mg/kg的5%玫瑰紅，立體定位儀固定小鼠頭部，沿頭正中切口分離、暴露左側(cè)顱骨。以矢狀縫左側(cè)2mm、冠狀縫后2mm為中心、直徑3mm為照射野，使冷光源(150W、24V金屬鹵化燈為發(fā)光光源，光導(dǎo)纖維傳送，濾去全部紫外線與紅外線，投射出單一綠色光束，波長(zhǎng)為530nm)光導(dǎo)纖維探頭垂直貼近暴露的顱骨。注射玫瑰紅后5min時(shí)打開冷光源，光照強(qiáng)度2Lx，照射10min后結(jié)束縫合頭部皮膚，局部碘酒消毒。假手術(shù)組僅照射冷光源，未注射玫瑰紅。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法，在腦梗死模型復(fù)制后24h處死動(dòng)物，取出腦梗死缺血半暗帶腦組織，液氮速凍，行冰凍切片，片厚度約10μm;用新鮮配制的4%多聚甲醛溶液固定，室溫30min;PBS洗片，滴加阻斷劑(0.3%H2O2甲醇溶液)，室溫孵育30min;PBS洗片，滴加通透液(0.1%Triton X-100溶于0.1%枸櫞酸溶液)，冰浴中孵育2min;PBS洗2遍，擦干樣品周圍液體，滴加50μl TUNEL反應(yīng)混合物，37℃濕盒中孵育60min;PBS洗片3次，1:1的甘油PBS溶液封片。應(yīng)用Bio-Red Radiance 2100型激光掃描共聚焦顯微鏡操作系統(tǒng)的Ar單通道激光系統(tǒng)，掃描陽(yáng)性反應(yīng)物。掃描選用的參數(shù)為:激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，觀測(cè)光為518nm，物鏡為40倍，掃描方式為點(diǎn)掃描，Zoom為1.0。經(jīng)Lasersharp 2000軟件攝像，每只動(dòng)物分別隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)30個(gè)不同視野TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算平均值用于分析。

1.6 Bcl-2、Bax和 Caspase-3 FITC 免疫熒光檢測(cè) 在腦梗死模型復(fù)制后24h死動(dòng)物，取出腦梗死缺血半暗帶腦組織，液氮速凍，行冰凍切片，片厚度約10μm。4%多聚甲醛固定30min，0.01mol/L PBS沖洗3次。滴加0.01mol/L PBS 1:10稀釋的正常血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體。滴加0.01mol/L PBS 1:200稀釋的兔抗鼠 Bcl-2、Bax和Caspase-3抗體，4℃過(guò)夜，0.01mol/L PBS 沖洗3 次。滴加0.01mol/L PBS 1:100稀釋的羊抗兔多克隆抗體，37℃ 孵育 30min，0.01mol/L PBS沖洗 3次。滴加0.01mol/L PBS 1:100稀釋的 SABC-FITC，37℃孵育30min，0.01mol/L PBS沖洗4次。然后滴加0.01mol/L PBS1:1稀釋的甘油封片。應(yīng)用Bio-Red Radiance 2100型激光掃描共聚焦顯微鏡操作系統(tǒng)的Ar離子激光系統(tǒng)，掃描FITC標(biāo)記的陽(yáng)性反應(yīng)物。掃描選用的參數(shù)為:激發(fā)光波長(zhǎng)為554nm，觀測(cè)光為575nm，物鏡為40倍，掃描方式為點(diǎn)掃描，Zoom 為(1.0)。經(jīng) Lasersharp 2000 軟件(4.5.3)攝像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有熒光圖片經(jīng)Lasersharp 2000軟件(4.5.3)處理后，每組隨機(jī)選取30張行熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)測(cè)定，數(shù)據(jù)以χ±s表示，由第一、二作者采用SPSS 10.0軟件包中的單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)元凋亡變化 熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果顯示，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞以綠色熒光表示。N組、C組切片偶見TUNEL陽(yáng)性(綠色熒光)細(xì)胞，CI組、HP+CI組陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0.01);HP+CI組與CI組相比，TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(P＜0.01)(見圖1、表1)。

2.2 各組Bcl-2表達(dá)熒光強(qiáng)度比較 Bcl-2蛋白主要位于神經(jīng)細(xì)胞胞漿、核膜及突起中，在本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記為綠色熒光。N組、C組切片僅見極少量免疫熒光表達(dá)，CI組可見Bcl-2免疫熒光強(qiáng)度增加，HP+CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Bcl-2免疫熒光強(qiáng)度明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01(見圖2、表2)。

2.3 各組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞以綠色熒光表示，N組、C組切片偶見陽(yáng)性細(xì)胞，CI組可見Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，HP+CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01(見圖2、表2)。

2.4 各組Bax表達(dá)熒光強(qiáng)度比較 Bax蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞胞漿、核膜及突起中，在本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記為綠色熒光。N組、C組僅見少量星點(diǎn)狀熒光，熒光強(qiáng)度極弱，HP+CI組免疫熒光強(qiáng)度增加，CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Bax免疫熒光強(qiáng)度明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01(見圖3、表3)。

2.5 各組Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 N組、C組切片偶見陽(yáng)性細(xì)胞，HP+CI組可見Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01(見圖3、表3)。

2.6 各組Bcl-2/Bax比值比較 各組Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比值發(fā)現(xiàn)，N組和C組相比，無(wú)明顯差異，P＞0.05;CI組與 N組、C組相比，Bcl-2/Bax比值明顯減少，P＜0.05;HP+CI組與N組、C組相比，Bcl-2/Bax比值明顯增加，P＜0.01;HP+CI組與CI組相比，Bcl-2/Bax比值明顯增加，P ＜0.01(見表4)。

2.7 各組 Caspase-3表達(dá)熒光強(qiáng)度比較 N組、C組切片僅見極少量免疫熒光表達(dá)，HP+CI組可見Caspase-3免疫熒光強(qiáng)度增加，CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Caspase-3免疫熒光強(qiáng)度明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01(見圖4、表5)。

2.8 各組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 N組、C組切片偶見陽(yáng)性細(xì)胞，HP+CI組可見Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01(見圖4、表5)。

表1 各組凋亡神經(jīng)元比較(χ ± s，n=6)

表2 各組Bcl-2表達(dá)熒光強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(熒光強(qiáng)度，χ ± s，n=6)

表3 各組Bax表達(dá)熒光強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(熒光強(qiáng)度，χ ± s，n=6)

表4 各組Bcl-2/Bax比值比較

表5 各組Caspase-3表達(dá)熒光強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(熒光強(qiáng)度，χ ± s，n=6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)急性腦梗死缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡的影響，既是低氧預(yù)適應(yīng)理論臨床應(yīng)用研究，又與傳統(tǒng)腦缺血損傷治療方法不同，側(cè)重于調(diào)動(dòng)組織細(xì)胞的一系列潛在的抗/耐低氧潛能和機(jī)制，從而獲得在低氧條件下保持機(jī)體組織細(xì)胞生命活動(dòng)的能力。我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用行為學(xué)、生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、神經(jīng)化學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，對(duì)低氧預(yù)適應(yīng)的效應(yīng)與機(jī)制進(jìn)行了一系列系統(tǒng)的研究并已作出了基本的概括［1～10］。隨著對(duì)HP發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)，將有助于臨床尋找防治缺血/缺氧性腦損傷的有效手段或藥物靶分子的研發(fā)。眾所周之，急性缺血性腦卒中是臨床常見的急重癥之一，死亡率高，致殘危險(xiǎn)性大，搶救急性腦梗死致腦缺血性損傷是其治療的關(guān)鍵，積極尋找腦缺血性損傷保護(hù)方法或藥物是研究的熱點(diǎn)或難點(diǎn)問(wèn)題［11～17］。我們既往研究發(fā)現(xiàn):低氧預(yù)適應(yīng)腦保護(hù)機(jī)制應(yīng)用到腦梗死臨床治療研究中，從腦梗死體積測(cè)定、神經(jīng)功能評(píng)定二個(gè)方面研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)適應(yīng)能明顯減少腦梗死面積，神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加，所以低氧預(yù)適應(yīng)能減少小鼠急性腦梗死體積、降低神經(jīng)功能評(píng)分，從而發(fā)揮腦梗死致缺血性損傷的保護(hù)作用［7］，但這種保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。

Bcl-2、Bax和Caspase-3分別是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡兩個(gè)分子家族中重要的成員，特別是在調(diào)節(jié)腦細(xì)胞凋亡中已經(jīng)得到廣泛證實(shí)。在眾多凋亡調(diào)節(jié)基因中，Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax的作用已得到廣泛證實(shí)，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡最后共同通路之一。細(xì)胞受到缺血/缺氧損傷時(shí)首先啟動(dòng)Bcl-2基因表達(dá)以抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2為 Caspase-3上游調(diào)控機(jī)制，Caspase-3則是引起凋亡的始發(fā)因子，Bcl-2的過(guò)量表達(dá)能有效地抑制Caspase-3的激活和細(xì)胞凋亡。正常情況下，Caspase-3以休眠狀態(tài)的酶原形式存在于正常細(xì)胞中，可經(jīng)線粒體依賴途徑和細(xì)胞表面死亡區(qū)包含的受體兩條不同途徑激活，活化后的Caspase-3可以切割許多蛋白質(zhì)底物，引起“瀑布式”的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞凋亡［5，6］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HP+CI組Bcl-2表達(dá)既顯著高于CI組;相反 Bax、Caspase-3表達(dá)低于 CI組，說(shuō)明低氧預(yù)適應(yīng)既能增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)又能抑制凋亡促進(jìn)因子Bax、Caspase-3的表達(dá)，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性，提高神經(jīng)元缺氧耐受性，抑制細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和凋亡進(jìn)程的發(fā)展，從而抑制急性腦梗死缺血半暗帶神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞的耐缺氧能力，這為我們之前HP研究中觀察到的HP能減少缺氧后細(xì)胞凋亡和壞死形態(tài)學(xué)改變，減輕動(dòng)物整體缺氧缺血后神經(jīng)功能損傷提供了證據(jù)［1～10］。低氧預(yù)適應(yīng)理論應(yīng)用是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，低氧預(yù)適應(yīng)理論在急性腦梗死中作用已有初步研究，相關(guān)機(jī)制也在探討中。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞凋亡及其機(jī)制方面進(jìn)行研究，李俊發(fā)等也研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用小鼠整體低氧預(yù)適應(yīng)和大腦中動(dòng)脈組塞(MCAO)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)MCAO所致缺血性損傷的影響，從新奇型蛋白激酶C(nPKC)膜轉(zhuǎn)位的變化、腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(CRMP-2)磷酸化水平、絲裂原和應(yīng)激激活蛋白激酶1(MSK-1)及cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化水平等方面，探討相應(yīng)保護(hù)機(jī)制［18～20］。研究發(fā)現(xiàn):HP可在一定程度上緩解MCAO小鼠的行為學(xué)改變，減少梗死區(qū)梗死面積、缺血區(qū)吸光度值和水腫率;進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，HP能緩解梗死區(qū)nPKC膜轉(zhuǎn)位水平的降低;緩解小鼠腦缺血皮質(zhì)缺血核心區(qū)內(nèi)CRMP-2磷酸化水平的降低和減少皮質(zhì)缺血半影區(qū)內(nèi)CRMP-2水解片段;提高缺血半影區(qū)內(nèi)MSK-1及其底物CREB的磷酸化水平，參與MCAO腦損傷腦保護(hù)機(jī)制。與本實(shí)驗(yàn)相比較，都明確肯定HP對(duì)急性腦梗死腦損傷的保護(hù)作用，不同之處在于從不同機(jī)制方面進(jìn)行研究?？傊?，低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)急性腦梗死缺血半暗帶神經(jīng)元具有抗凋亡作用，與增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)又能抑制凋亡促進(jìn)因子Bax、Caspase-3的表達(dá)機(jī)制有關(guān)。

［1］Shao G，Gao CY，Lu GW.Alterations of hypoxia-inducible factor-1 alpha in the hippocampus of mice acutely and repeatedly exposed to hypoxia［J］.Neurosignals，2005，14(5):255-261.

［2］Shao G，Zhang R，Wang ZL，et al.Hypoxic preconditioning improves spatial cognitive ability in mice［J］.Neurosignals，2006-2007，15(6):314-321.

［3］Shao G，Gong KR，Li J，et al.Antihypoxic effects of neuroglobin in hypoxia-preconditioned mice and SH-SY5Y cells［J］.Neurosignals，2009，17(3):196-202.

［4］牛敬忠，張顏波，李美藝，等.低氧預(yù)適應(yīng)大鼠腦脊液減輕氧糖剝奪對(duì)培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)元的損傷及可能的機(jī)制［J］.生理學(xué)報(bào)，2011，63(6):491-497.

［5］張顏波，呂國(guó)蔚，楊明峰，等.低氧預(yù)適應(yīng)小鼠海馬Bcl-2表達(dá)和Caspase-3活性的變化［J］.中華神經(jīng)科雜志，2007，40(8):553-555.

［6］張顏波，呂國(guó)蔚，楊明峰，等.低氧預(yù)適應(yīng)小鼠皮層 Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)變化［J］.生理學(xué)報(bào)，2008，60(2):249-253.

［7］牛敬忠，張顏波，楊明峰，等.低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)小鼠急性腦缺血性損傷保護(hù)作用的研究［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2009，8(8):777-780.

［8］楊明峰，張顏波，孫保亮，等.低氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液提取液對(duì)大鼠鼠胚海馬神經(jīng)元缺氧復(fù)氧后神經(jīng)細(xì)胞的影響［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2007，8(11):1094-1097.

［9］張顏波，呂國(guó)蔚，楊明峰，等.低氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦室管膜bcl-2表達(dá)和caspase-3活性變化［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2007，6(10):986-988.

［10］張顏波，楊明峰，孫保亮，等.低氧預(yù)適應(yīng)刺激腦海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(36):6699-6702.

［11］Lin YF，Li YD，Zang DW.Effects of leukemia inhibitory factor on endogenousneural stem cell proliferation and glycoprotein-130 expression in a mouse model of cerebral infarction［J］.Neural Regen Res，2011，6(19):1452-1456.

［12］Jiang W，Li LB，Yang M，et al.Influence of acupuncture with exercise training on learning and memory functions，as well as microtubule-associated protein-2 and synaptophysin expression in the hippocampal CA3region，in a rat model of cerebral infarction［J］.Neural Regen Res，2011，6(27):2124-2128.

［13］Zhao SC，Chu ZH，Ma LS，et al.Significance of neuroglobin in serum of acute atherosclerotic cerebral infarction patients［J］.Neural Regen Res，2011，6(27):2140-2145.

［14］Song YQ，Zou HL，Wang GF，et al.Matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in early focal cerebral infarction following urokinase thrombolysis in rats［J］.Neural Regen Res，2012，7(17):1325-1330.

［15］Huang WH，Li YD，Lin YF，et al.Effects of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor on free radicals and endogenous stem cell proliferation in a mouse model of cerebral infarction［J］.Neural Regen Res，2012，7(19):1469-1474.

［16］Zhang XN，Li YY，Guo XB，et al.Relationship between the-455G/A and-148C/T polymorphisms in the beta-fibrinogen gene and cerebral infarction in the Xinjiang Uygur and Han Chinese populations［J］.Neural Regen Res，2012，7(7):546-551.

圖1 各組凋亡細(xì)胞免疫熒光染色(×40)

圖2 各組缺血半暗帶神經(jīng)元Bcl-2 FITC染色(×40)

圖3 各組缺血半暗帶神經(jīng)元Bax FITC染色(×40)

圖4 各組缺血半暗帶神經(jīng)元Caspase-3 FITC染色(×40)

［17］Yang ZH，Sheng WL，Shen HY，et al.Bilateral olfactory ensheathing cell transplantation promotes neurological function in a rat model of cerebral infarction［J］.Neural Regen Res，2011，6(13):983-987.

［18］江 君，楊巍巍，張 楠，等.低氧預(yù)適應(yīng)減輕腦中動(dòng)脈阻塞所致小鼠缺血性腦損傷［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，29(2):113-118.

［19］張彩艷，封素娟，劉 旭，等.腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-2參與低氧預(yù)適應(yīng)減輕小鼠腦缺血損傷［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，29(11):1133-1138.

［20］杜建麗，梁 婧，李沫音，等.MSK-1和CREB參與低氧預(yù)適應(yīng)降低小鼠缺血性腦損傷［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(11):1143-1148.