吳宇寬,趙靜,高進(jìn),唐澈,余靜

(湖北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,湖北 武漢 430070)

0 引言

阿維菌素(avermectin)和甲維鹽(甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽,emamectin)屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,致毒機理獨特,是高效、廣譜的新型抗生素類殺蟲殺螨劑,對線蟲和節(jié)肢動物驅(qū)殺效果好,在國內(nèi)廣泛應(yīng)用于蔬菜和水果蟲害的防治[1-2].但阿維菌素和甲維鹽的過量使用使其在農(nóng)產(chǎn)品中高殘留,害蟲已產(chǎn)生抗藥性,因此各國都已限量使用.由于阿維菌素和甲維鹽屬于脂溶性藥物,在動物體內(nèi)的殘留時間較長[3].根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的5級分類標(biāo)準(zhǔn),阿維菌素和甲維鹽被列為高毒化合物.歐盟規(guī)定最大殘留限量值為0.01 mg/kg[4],我國規(guī)定的最大殘留限量值為0.02～0.05 mg/kg[5].

目前檢測阿維菌素和甲維鹽的主要方法有免疫分析法[6]、高效液相色譜-熒光檢測法等[7-9].免疫分析法方便、快捷,適合大批量樣品篩選,但是不能確定具體的藥物類型,且存在假陽性的現(xiàn)象,不能作為確證方法.高效液相色譜-熒光檢測法應(yīng)用較多,方法檢出限較低,能達(dá)到檢測要求,但是需要繁瑣的衍生化反應(yīng).近年來,高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)開始應(yīng)用于阿維菌素類藥物殘留的檢測,此方法對前處理要求不高,靈敏度高,且同時可以排除假陽性、避免基質(zhì)效應(yīng),定量準(zhǔn)確[10-12].

本文中采用高效液相色譜-加熱電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC/HESI-MS/MS),建立了同時測定蔬菜、水果中阿維菌素和甲維鹽的方法.該方法快速、高效、靈敏度高、重復(fù)性好,適用于蔬菜、水果中阿維菌素和甲維鹽的分析確證.

1 材料與方法

1.1材料與試劑阿維菌素和甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品,純度均為99%(德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司);甲酸、甲醇、乙腈、二氯甲烷和乙酸銨,均為色譜純(美國J.T.BAKER公司);氯化鈉(NaCl),分析純(上海國藥集團(tuán)公司);實驗用水為超純水,由Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得.

1.2儀器與設(shè)備TSQ Quantum Ultral EMR液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有加熱電噴霧電離源(美國Thermo公司);T25高速分散機(德國IKA公司);3K15高速離心機(德國Sigma公司);固相萃取小柱:Amino Box(500 mg,6 mL)(美國Agilent公司).

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制稱取10.0 mg阿維菌素或者甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液,保存于4 ℃冰箱中,使用時用基質(zhì)空白溶液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液.

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 對8種蔬菜、水果進(jìn)行實驗,分別為西紅柿、芹菜、花菜、四季豆、韭菜、白菜、梨和蘋果.將樣品按4分法取樣,置于食物料理機中打碎,然后裝入樣品盒,在-20 ℃下保存.實驗前將樣品盒取出放至常溫,用50 mL離心管稱取10 g樣品,加入20 mL乙腈,在高速分散機上以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速勻漿2 min,再在離心機上以5 000 r/min離心10 min,另取一50 mL離心管,加入約3 g NaCl,將上清液倒入此離心管,加蓋振搖1 min,靜置30 min,取10 mL上層有機相于10 mL離心管中,在70 ℃水浴下用氮氣吹至近干.

1.4.2 凈化 先用4 mL甲醇/二氯甲烷(5/95,v/v,全文同)溶液預(yù)淋洗活化Amino SPE柱,再依次用4、4、2 mL的甲醇/二氯甲烷(5/95)溶液分3次加入10 mL樣品離心管中,漩渦儀震蕩,過Amino SPE柱洗脫,用10 mL離心管收集洗脫液,于50 ℃的水浴中氮吹至近干,加入3 mL甲醇,在渦旋儀上渦旋0.5 min,再用水定容至5 mL,混勻后過0.2 μm有機濾膜,待測.

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold C18,100 mm×2.1 mm,5 μm(i.d.);流動相:A為

表1 阿維菌素和甲維鹽的母離子、子離子及碰撞能量

*定量離子

甲醇(含0.1%甲酸),B為0.2%乙酸銨;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:200 μL/min;運行時間:10 min.

1.5.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件:加熱電噴霧離子源(HESI),正離子模式采集;掃描模式:SRM;干燥氣:氮氣;鞘氣/輔助氣:30/10 units;離子傳輸管溫度:270 ℃;噴霧電壓:3 000 V.其他參數(shù)見表1.

2 結(jié)果與分析

2.1樣品的凈化采用固相萃取法凈化,常用的固相萃取小柱有氨基柱(洗脫液為甲醇∶二氯甲烷=95∶5)、氟羅里硅土柱(洗脫液為丙酮∶正己烷=10∶90)、石墨碳黑氨基串聯(lián)柱(洗脫液為乙腈∶甲苯=3∶1).本實驗比較了幾種萃取柱的凈化效果和回收率,結(jié)果表明:氟羅里硅土柱和石墨碳黑氨基串聯(lián)柱對目標(biāo)物的吸附能力較強,難以洗脫,造成回收率偏低,而氨基柱的回收率均在70%～110%之間,同時正己烷和甲苯的毒性較大,盡量避免使用,因此選用氨基柱作為萃取柱,洗脫體系為甲醇-二氯甲烷(95∶5).

2.2檢測條件的優(yōu)化在正離子模式檢測條件下對1 mg/L的阿維菌素和甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動注射的方式進(jìn)行母離子掃描,確定其分子離子,然后在選擇反應(yīng)監(jiān)測模式下自動優(yōu)化,再對子離子進(jìn)行全掃描.選擇豐度較高、干擾較少的兩個子離子為定性離子,豐度最高的離子作為定量離子,優(yōu)化其碰撞能.優(yōu)化后得到的質(zhì)譜條件見表1.

圖1 阿維菌素和甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇反應(yīng)監(jiān)測譜圖

流動相的組成對LC-MS/MS測定的靈敏度和色譜峰的分離度有很大影響,通常使用有一定酸度的流動相以使被分析物容易質(zhì)子化而帶正電荷,從而提高檢測的靈敏度.在流動相中加入0.1%甲酸溶液時,分離效果良好,峰形得到改善,質(zhì)譜響應(yīng)值較高,同時,在流動相中加入乙酸銨可促進(jìn)母離子的形成.本實驗以0.1%的甲醇-0.2%的乙酸銨作為流動相,結(jié)果表明,可得到較好的峰形和分離效果.在上述優(yōu)化的條件下,阿維菌素和甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇反應(yīng)監(jiān)測譜圖見圖1,從中可以看出阿維菌素和甲維鹽的峰形和分離度較好,峰值較高,分析時間較短.

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限在西紅柿樣品中加入一系列不同濃度的阿維菌素和甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成質(zhì)量濃度為5～50 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗方法處理樣品,按儀器工作條件進(jìn)行測定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x、峰面積為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求得回歸方程和相關(guān)系數(shù).阿維菌素和甲維鹽在5.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.995(見表2).以樣品空白信噪比(S/N)的10倍計算檢出限,阿維菌素和甲維鹽的檢出限均為2 μg/kg.

表2 阿維菌素和甲維鹽的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.4回收率與精密度在所檢測的8個樣品中分別加入5.0、10.0和20.0 μg/kg各3個濃度水平的阿維菌素和甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行回收率實驗,每個水平重復(fù)測定6次,平均回收率范圍為72.3%～108.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.6%～12.6%(表3).

3 結(jié)論與討論

本文中采用乙腈高速勻漿提取樣品,氨基固相萃取柱凈化,在加熱電噴霧離子源正離子模式采集、三重四級桿質(zhì)譜儀選擇性反應(yīng)監(jiān)測模式下,對蔬菜、水果中阿維菌素和甲維鹽藥物殘留進(jìn)行了測定.該方法前處理簡單,靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均較高,各種指標(biāo)符合殘留檢測的相關(guān)要求,可用于蔬菜、水果中阿維菌素和甲維鹽殘留的檢測.

表3回收率和精密度試驗結(jié)果(n=6)

續(xù)表3

樣品阿維菌素甲維鹽加入量/(μg/kg)回收率/%RSD/%加入量/(μg/kg)回收率/%RSD/%5.077.07.35.076.98.2芹菜10.085.88.410.079.66.420.0102.25.520.082.37.15.083.711.05.088.45.8花菜10.079.16.310.093.67.520.096.56.220.0105.36.65.077.28.95.082.49.6四季豆10.086.85.710.078.38.720.095.46.420.094.09.15.076.57.75.072.39.6韭菜10.083.28.610.081.412.620.088.75.920.086.56.55.082.68.45.086.57.2白菜10.091.38.210.090.88.420.0108.65.720.0106.43.65.079.65.85.085.710.6梨10.084.18.010.092.86.520.096.39.320.0102.88.55.078.28.75.083.38.0蘋果10.084.69.510.089.66.220.093.86.120.096.67.1

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