王宗春,郭咸希

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部,湖北 武漢 430060)

0 引言

注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣為淡黃色塊狀物或粉末,臨床主要用于心絞痛、急性心肌梗死的輔助治療,也可用于治療心肌炎、心源性休克、手術(shù)后網(wǎng)膜下出血和銀屑病,并可輔助其他抗癌藥治療白血病.

熱原是引起臨床輸液反應(yīng)的主要原因,必須嚴(yán)格控制靜脈給藥注射液的熱原,中國(guó)藥典關(guān)于注射劑控制熱原方法有家兔法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(鱟試劑法)[1],后者具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn),已被各國(guó)藥典所采用,目前尚少有該制劑采用鱟試劑法檢查熱原的報(bào)道,筆者應(yīng)用鱟試劑法對(duì)注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣進(jìn)行了研究,為該品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法的建立提供依據(jù),旨在確保其臨床用藥的安全性.

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣4批次(上海第一生化藥業(yè)有限公司,每瓶20 mg,批號(hào)分別為1110091、1203102、1205101、1209121);鱟試劑(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠,規(guī)格0.1 mL,批號(hào)110124,靈敏度0.5 EU/mL);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司,規(guī)格0.1 mL,批號(hào)111207,靈敏度0.5 EU/mL);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,每支10 EU,批號(hào)2011-07);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠,每支2 mL,批號(hào)120307);SW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);微量取液器(50～250 μL)(上海金林生化試劑儀器廠);恒溫水浴箱(江蘇南通嘉程儀器有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用具(湛江安度斯生物有限公司).

1.2細(xì)菌內(nèi)毒素備用液的配制將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解,在旋渦混合器上混勻15 min,配制成濃度為10 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液,備用.

1.3鱟試劑靈敏度試驗(yàn)將上述細(xì)菌內(nèi)毒素備用液稀釋成2.00、1.00、0.50、0.25λ4個(gè)濃度等級(jí)的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30 s,每一濃度平行做4支,每管加入鱟試劑0.1 mL和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL.同時(shí)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做2支陰性對(duì)照管,共18管,輕輕混勻后,封閉管口,垂直放入(37±1) ℃恒溫水浴箱中,保溫(60±2) min,將反應(yīng)管輕輕取出,緩緩倒轉(zhuǎn)180°,觀察結(jié)果,若管內(nèi)形成凝膠,并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性(+);未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性(-).

1.4供試品最大不干擾濃度試驗(yàn)

1.4.1 預(yù)試驗(yàn) 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣溶解,并配制成濃度分別為80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的倍比系列溶液(Negative Product Control,NPC),在每一濃度下加入細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液,使每一稀釋濃度的供試品溶液中都含有1.0 EU/mL細(xì)菌內(nèi)毒素(Positive Product Control,PPC)[2],取上述各溶液0.1 mL加入到已復(fù)溶的兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑(λ為0.5 EU/mL)管內(nèi),每個(gè)濃度重復(fù)2管,設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,按藥典方法進(jìn)行反應(yīng).

1.4.2 確證試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,取濃度為20 mg/mL的供試品溶液及BET水,加入細(xì)菌內(nèi)毒素備用液,配制成細(xì)菌內(nèi)毒素最終濃度分別為1.000、0.500、0.250 EU/mL的系列溶液,分別取0.1 mL加入到已復(fù)溶的兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑管內(nèi),每個(gè)濃度平行做4管,另取供試品溶液做2支陰性對(duì)照管,進(jìn)行供試品溶液(濃度為20 mg/mL)干擾確證試驗(yàn)[3-5].

2 結(jié)果與分析

2.1鱟試劑靈敏度試驗(yàn)結(jié)果2批鱟試劑的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示,最大濃度2λ管均為陽(yáng)性,最低濃度0.5λ管均為陰性,陰性對(duì)照管為陰性,廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)的鱟試劑(批號(hào)110124)靈敏度測(cè)定值λc=0.42,湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑(批號(hào)111207)靈敏度測(cè)定值λc=0.50,均在0.5λ～2.0λ之間,說(shuō)明2批鱟試劑其靈敏度均符合要求,可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查.

2.2 供試品最大不干擾濃度

2.2.1 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 表1為干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,顯示當(dāng)濃度為80 mg/mL時(shí),4個(gè)批號(hào)的供試品均對(duì)鱟試劑的凝集反應(yīng)有抑制作用,濃度為40 mg/mL時(shí)部分批號(hào)的供試品對(duì)凝集反應(yīng)有抑制作用,而當(dāng)濃度等于或低于20 mg/mL時(shí)抑制作用消失,可以初步判斷供試品最大不干擾濃度為20 mg/mL.

2.2.2 干擾確證試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇濃度為20 mg/mL的供試品溶液進(jìn)行干擾確證試驗(yàn),結(jié)果見表2、3.Et為用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值,Es為用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值,結(jié)果顯示Et/Es在0.5～2.0之間,按照中國(guó)藥典判斷標(biāo)準(zhǔn),濃度為20 mg/mL的供試品溶液對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間凝集反應(yīng)既無(wú)抑制作用,也無(wú)增強(qiáng)現(xiàn)象,說(shuō)明供試品最大不干擾濃度為20 mg/mL.

表1 供試品干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

“+”表示反應(yīng)呈陽(yáng)性;“-”表示反應(yīng)呈陰性(下同).

表2 供試品(20 mg/mL)干擾確證試驗(yàn)結(jié)果(鱟試劑批號(hào)110124)

表3 供試品(20 mg/mL)干擾確證試驗(yàn)結(jié)果(鱟試劑批號(hào)111207)

2.3 注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的確定

2.3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的計(jì)算L=K/(M·f)[6],M為人用最大供試品劑量,按照注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣說(shuō)明書,成人1次最大劑量為2支(40 mg),溶解于5%葡萄糖注射液,靜脈滴注,M=40÷(60×1)=0.667 mg·kg-1·h-1(人均體重按60 kg計(jì)算,滴注時(shí)間以1 h計(jì));式中K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量,中國(guó)藥典規(guī)定注射劑K=5 EU·kg-1·h-1;f為安全系數(shù),由于本品主要用于心絞痛、急性心肌梗死等疾病的治療,同時(shí)考慮到葡萄糖注射液也含有細(xì)菌內(nèi)毒素,為了嚴(yán)格控制熱原,將安全系數(shù)f定為3.0,則本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=5.0/(0.667×3.0)=2.5 EU/mg.

2.3.2 供試品有效稀釋濃度(C) 供試品有效稀釋濃度C=λ/L,L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值(2.5 EU/mg),λ為鱟試劑靈敏度(0.5 EU/mL)時(shí),對(duì)應(yīng)的C為0.2 mg/mL.

2.3.3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 由于供試品有效稀釋濃度C為0.2 mg/mL,遠(yuǎn)小于該品的最大不干擾濃度(20 mg/mL),當(dāng)某一濃度的供試品對(duì)凝集反應(yīng)不存在干擾作用時(shí),比該濃度低的供試品也一定不存在干擾作用[6],因此可以將供試品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解并稀釋至濃度為0.2 mg/mL,依中國(guó)藥典2010年版(二部)附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查,細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為2.5 EU/mg.

3 討論

鱟試劑是目前國(guó)際上公認(rèn)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用試劑,可用于放射性、生物制品、化學(xué)藥及中藥等藥物的滅菌制劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè),但由于很多藥品對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間的凝集反應(yīng)具有抑制或增強(qiáng)的干擾作用,出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象,限制了鱟試劑的應(yīng)用,只有證實(shí)供試品在有效稀釋濃度范圍內(nèi)對(duì)凝集反應(yīng)無(wú)干擾,鱟試劑方法的結(jié)果方能有效可信.本研究的干擾預(yù)試驗(yàn)顯示,高濃度(80 mg/mL)的二丁酰環(huán)磷腺苷鈣溶液會(huì)抑制鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間的凝集反應(yīng),但通過(guò)稀釋至濃度為20 mg/mL時(shí)干擾作用消失,并通過(guò)干擾確證試驗(yàn)得到驗(yàn)證,即該品的最大不干擾濃度為20 mg/mL.

按照中國(guó)藥典2010年版(二部)附錄計(jì)算得到注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為2.5 EU/mg,當(dāng)使用靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑時(shí),對(duì)應(yīng)的供試品有效稀釋濃度為0.2 mg/mL,低于最大不干擾濃度(20 mg/mL),因此使用鱟試劑法檢測(cè)該品的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的.

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版二部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄99-101.

[2] 王宗春,張洪,姜俊勇.鱟試劑方法檢測(cè)胎盤多肽注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素[J].湖北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,33(2):190-192.

[3] 蔡彤,張國(guó)來(lái),李波,等.84種注射用藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2010,45(2):150-155.

[4] 潘衛(wèi)松,肖瑛,潘建明.熒光素鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國(guó)藥房,2009,20(13):1010-1012.

[5] 李浩,李健和,葉清.尼扎替丁氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J].中國(guó)藥業(yè),2009,18(4):38-39.

[6] 黃清泉,夏振民.藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1997,32(2):72-74.