康曉冬 馬小明

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院草畜工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750002）

1 材料和方法

1.1 試劑

1.1.1 2 mol/L磷酸鹽緩沖液 （含0.15 mol/L氯化鈉，pH7.2）稱取氯化鈉8.850 g，二水磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.226 g和十二水磷酸氫二鈉（NaH2PO4·12H2O）1.698 g溶于適量水中，調(diào)pH至7.2，加水至1 000 ml。

1.1.2 供試品處理液 量取20%二乙醇胺0.25 ml和10% Triton X-100 0.20ml，加pH7.2PBS至10 ml。

1.1.3 20%二乙醇胺儲(chǔ)備液 量取二乙醇胺DEA（在室溫下該品可能會(huì)邊厚或者結(jié)晶使用前可加熱到30℃以液化）2 ml。加pH7.2PBS至10 ml。置于棕色瓶中室溫保存，室溫暗處可保存4個(gè)月。供試品稀釋液取牛血清白蛋白10.0 g，加磷酸鹽緩沖液使溶解成1 000 ml，即得。

1.1.4 10% Triton X-100儲(chǔ)備液 量取1ml10% Triton X-100加PH7.2PBS至10 ml。室溫可保存4個(gè)月。如果該溶混濁請(qǐng)勿使用。

1.1.5 1%硫柳汞溶液 稱取硫柳汞1g，加pH7.2PBS至100ml，溶解即。

1.1.6 樣品稀釋液 1%BSA，0.01%硫柳汞溶液，用PBS溶解。

1L的配制方法：取BSA10.0 g置于燒杯中，加pH7.2PBS溶液，約800 ml。磁力攪拌溶解。加1%硫柳汞溶液10.0 ml，再用pH7.2PBS溶解定容至1 000 ml。分裝成合適的體積于2℃～8℃暗處保存，有效期1個(gè)月。

1.1.7 參考品溶液及供試品溶液的配制 分別精密量取參考品及供試品0.1 ml，加入0.1 ml 供試品處理液，加蓋混勻，在20℃～28℃靜置30～35 min。將處理后的參考品和供試品以供試品稀釋液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，稀釋后取1：2 000、1：4 000、1：8 000、1：16 000、1：32 000倍及其他適宜稀釋度的參考品和供試品，每個(gè)稀釋度作雙份測(cè)定。陰性對(duì)照為供試品稀釋液（雙份），陰性和陽(yáng)性對(duì)照不需稀釋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用單克隆抗─HBS包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)，加入多克隆抗-HBS-HRP，當(dāng)標(biāo)記中存在HBSAg時(shí)，該HBSAg與包被抗-HBS結(jié)合并與抗-HBS-HRP結(jié)合形成抗-HBS-HBSAg-HRP復(fù)合物，加入TMB產(chǎn)生顯色底物，反之，則無(wú)顯色底物生成。該檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)比，定量檢測(cè)HBSAg 鋁佐劑疫苗的量，在進(jìn)行檢測(cè)前將疫苗樣品和標(biāo)準(zhǔn)品與二乙醇胺和Triton X―100溶液孵育，目的以減少抗原聚集和提高“AUSIY ME”ELISA法檢測(cè)樣品的可行性。通過(guò)對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值的分析，可檢測(cè)樣品的相對(duì)效力值。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀（SUNRISE 雙波長(zhǎng)）

2 檢測(cè)程序

2.1 樣品處理試劑盒要放培養(yǎng)箱（37℃）前0.5h（三批樣品）。

2.2 所有樣品均應(yīng)在2℃～8℃保存。處理前將參考品溶液和樣品溶液在旋渦混合器混合10s左右。

2.3 用前搖動(dòng)處理液的瓶子以混合均勻。

2.4 分別吸取0.1 ml參考品和樣品加到EP管中，然后每管加0.1 ml處理液。加蓋，旋渦混合10s，20℃～28℃靜置30～35min。

2.5 樣品稀釋

將處理過(guò)后的參考品和供試品分別以樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，如下表1：

表1

2.6 測(cè)定順序

（1）每孔加待測(cè)標(biāo)本50微升，設(shè)印行對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照各2孔，每孔加入陰性對(duì)照（或陽(yáng)性對(duì)照）各2滴，設(shè)空白對(duì)照2孔。

（2）每孔加入酶結(jié)合物1滴（空白對(duì)照除外），充分混勻，封板，置37℃孵育30 min。

（3）手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔。靜置58s，甩干，重復(fù)5次拍干。

（4）每孔加入顯色劑A液、B液各一滴，充分混勻，封板，置37℃孵育15 min。

（5）每孔加入終止液各1滴，混勻。

（6）用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450 nm，630 nm，先用空白孔較零，然后讀取各孔OD值。

2.7 結(jié)果計(jì)算

（1）計(jì)算陰性對(duì)照的平均吸光值（NCX），必須落在－0.06～0.1范圍內(nèi)。如果某個(gè)數(shù)值落在這個(gè)范圍之外，則將這個(gè)數(shù)值重新計(jì)算平均值；如果兩個(gè)數(shù)值落在此范圍之外，則應(yīng)作檢測(cè)；如果更多的數(shù)值落在范圍之外，則應(yīng)對(duì)其中的技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行修正。

（2）計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照平均吸光值排除PCX。

（3）計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照－陰性對(duì)照（PCX －NCX），PCX －NCX應(yīng)≥0.400值。否則應(yīng)檢查技術(shù)問(wèn)題或試劑是否變質(zhì)，重新進(jìn)行試驗(yàn)。

（4）每個(gè)稀釋液對(duì)照稀釋度應(yīng)當(dāng)在0～0.02范圍內(nèi)。

2.8 相對(duì)效力計(jì)算

2.8.1 列出每次測(cè)得的參考品和待檢樣品的每個(gè)稀釋度比例的所有吸光值。

2.8.2 從3個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)中，用平行線性回歸分析法計(jì)算每次的相對(duì)效力。

2.8.3 三次相對(duì)效力的幾何平均值即為其體外效力。

2.9 檢測(cè)結(jié)果

以凍干品為標(biāo)準(zhǔn)品，三次相對(duì)效力幾何平均值應(yīng)≥0.5。結(jié)果判為合格。

3 討論

由于疫苗制品的檢定一般多采用生物學(xué)方法測(cè)定，因此在檢定中就難免出現(xiàn)檢定結(jié)果準(zhǔn)確性不佳，究其原因不外乎有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異性，所用試劑和原材料的純度或敏感性不一致等。因此必須對(duì)現(xiàn)有檢定方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和可信性研究。同時(shí)必須采用新技術(shù)，建立新的準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的檢定方法，提高疫苗制品的檢定工作質(zhì)量。而質(zhì)量檢定人員也應(yīng)本著對(duì)人民極端負(fù)責(zé)的精神，嚴(yán)格按照《生物制品規(guī)程》要求，對(duì)制品進(jìn)行科學(xué)檢定。此外還應(yīng)意識(shí)到，疫苗制品的質(zhì)量是生產(chǎn)出來(lái)的，檢定只是客觀反映制品的質(zhì)量問(wèn)題，從而促進(jìn)質(zhì)量的提高，而只有對(duì)生產(chǎn)過(guò)程實(shí)施全面的質(zhì)量管理才能全面有效地保證疫苗的質(zhì)量水品，生產(chǎn)好的疫苗制品，造福人類。因此在重組（酵母）乙肝疫苗體外效力的檢測(cè)中一定要認(rèn)真負(fù)責(zé)，同時(shí)也應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)問(wèn)題：

（1）待檢測(cè)樣品溶液中不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的酶、底物、酶抑制劑和其他干擾因素，以防止干擾作用。

（2）吸附的效果與包被緩沖液的濃度、pH、溫育時(shí)間有關(guān)，還與載體表面積性質(zhì)有關(guān)。包被蛋白質(zhì)時(shí)緩沖液宜偏堿性，離子強(qiáng)度較低，這有利于蛋白質(zhì)的吸附，包被緩沖液（pH＜6＝時(shí)非特異性吸附增加，實(shí)驗(yàn)中包被時(shí)常采用50mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液，聚苯乙烯塑料表面能吸附轉(zhuǎn)移多的蛋白質(zhì)，常用濃度1～10μg/ml的免疫球蛋白。濃度過(guò)高，蛋白質(zhì)間的相互作用防礙了蛋白質(zhì)與聚苯乙烯載體的吸附，不僅浪費(fèi)試劑，還會(huì)降低檢測(cè)的靈敏度。包被物質(zhì)必須是可容的，最適濃度可通過(guò)棋盤滴定法加以確定。

（3）聚苯乙烯酶標(biāo)記板測(cè)定時(shí)，溶液宜垂直滴入凹孔中間，相繼加入的溶液都覆蓋相同的載體表面積。在吸附溫育和洗滌等操作中應(yīng)避免劇烈振蕩，攪拌等，以保證恒定的吸附容量。在洗滌操作中，由于聚苯乙烯反應(yīng)板凹孔容量小，孔間距離近，故洗滌時(shí)要注意每次加入的洗滌液量既要達(dá)到洗滌充分又要避免相鄰孔內(nèi)液體互相污染。

（4）在ELISA中血清陰性對(duì)照的顯色反應(yīng)常常是酶結(jié)合物與固相之間的非特異性吸附所致。在酶結(jié)合物稀釋時(shí)加去污劑（TWEEN）或BSA。

重組（酵母）乙肝疫苗體外效力的測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)疫苗的價(jià)值具有十分重要的意義。

[1]郝福英.生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：北京大學(xué)出版社，2004.

[2]張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1982.

[3]焦奎，張書圣.酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[4]林清華.免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].武漢：武漢大學(xué)出版社，1999.