王娟，俞力，范鈺

(1.江蘇大學附屬醫(yī)院輸血科，江蘇鎮(zhèn)江212001;2.江蘇大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇鎮(zhèn)江212001;3.江蘇大學附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇鎮(zhèn)江212002)

近年來，甲狀腺癌發(fā)病率逐漸增高，由于發(fā)現(xiàn)較晚，部分患者確診時甲狀腺癌出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，給臨床治療帶來了一定困難。檢測腫瘤分子標志物并探討其相關(guān)致病分子機制，將有效改善甲狀腺癌診斷的整體水平。

越來越多的研究表明，多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與微小RNAs的異常表達有著密切關(guān)系［1－3］。微小RNAs是RNA信號傳導通路中一個極其重要的調(diào)控分子，可通過不同表達方式調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡等［1］。近年來，很多研究者發(fā)現(xiàn)，miR-155在多種實體瘤組織或細胞中高表達，如乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、胰腺導管腺癌(PDAC)等［4－7］，且與癌細胞增殖有關(guān)。但有關(guān) miR-155在人甲狀腺癌體外細胞中的作用研究甚少［8］，本課題利用反義寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotides，AS)下調(diào)miR-155的表達，觀察反義寡核苷酸對人甲狀腺癌BCPAP細胞系生長侵襲的影響，探討miR-155在甲狀腺癌發(fā)病中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺癌BCPAP細胞系購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，本院組織細胞生物庫凍存;DMEM及胎牛血清(美國Gibco公司);細胞培養(yǎng)板和Transwell板(美國Coring公司);細胞裂解緩沖液及發(fā)光底物(美國Promega公司);基質(zhì)膠(美國BD公司)。人基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)ELISA試劑盒(美國Calbiochem公司)。

1.2 反義寡脫氧核苷酸轉(zhuǎn)染

使用DMEM培養(yǎng)液在37℃，5%CO2的常規(guī)條件下培養(yǎng)人甲狀腺癌BCPAP細胞。AS-miR-155序列:5'-TCCCCTATACACGATTAGCATTAA-3';無義寡核苷酸(oligodeoxyribonucleotides，ODN)序列:5'-ATCTCATACTACACTTGAACACT-3'，依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，加入等體積PBS以建立空白對照組。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測miR-155 mRNA的表達

抽提細胞總RNA并精制，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。定量 PCR(miR-155)上游引物:5'-CGCGCTTAATGCTAATCGTGA-3';下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，長度為 62 bp。GAPDH(作為內(nèi)參)上游引物:5'-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3';下游引物:5'-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3'，長度為115 bp。反應(yīng)循環(huán)條件及計算方法參照文獻［9］進行。

1.4 劃痕法檢測癌細胞遷移能力

①先在細胞培養(yǎng)板背后均勻地劃橫線，大約每隔1 cm一道，橫穿過孔。②培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，消化并計數(shù)、使用培養(yǎng)基配制成濃度為8×105個/mL的細胞懸液。培養(yǎng)板中每孔加入1 mL細胞懸液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至細胞鋪滿單層;③ 用100 μL移液槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃線;④棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞;⑤ 細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后拍照，計算間距。

1.5 Transwell檢測癌細胞侵襲力

參照文獻［9］的方法，使用倒置顯微鏡(×100)觀察穿過聚碳酸酯膜微孔的細胞數(shù)，在每張膜的中央及周圍部分隨機取3個視野，計數(shù)每個視野內(nèi)的穿膜細胞數(shù)。

1.6 ELISA法檢測癌細胞MMP-13含量

收集各組細胞上清液，采用MMP-13 ELISA試劑盒通過夾心酶聯(lián)免疫方法測定MMP-13含量，具體步驟參照說明書。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組轉(zhuǎn)染效果的比較

AS-miR-155組轉(zhuǎn)染后，BCPAP細胞miR-155 mRNA表達水平明顯低于空白對照組和無義ODN組(P＜0.05)。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的反義寡核苷酸明顯下調(diào)了BCPAP細胞中miR-155 mRNA水平(圖1)。

圖1 miR-155反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對miR-155 mRNA表達的影響

2.2 As-miR-155轉(zhuǎn)染對癌細胞遷移力的影響

劃痕試驗結(jié)果顯示，空白對照組和無義ODN組間距分別為(532±26)μm 和(518±22)μm，而轉(zhuǎn)染AS-miR-155組間距為(785±28)μm，AS-miR-155組間距明顯大于對照組和無義ODN組(F=172.461，P=0.000)。結(jié)果提示AS-miR-155組細胞遷移速度明顯變慢。

2.3 AS-miR-155轉(zhuǎn)染對癌細胞侵襲的影響

應(yīng)用Transwell檢測癌細胞侵襲能力，結(jié)果顯示平均每個視野穿膜細胞數(shù)空白對照組為43.8±2.6，無義 ODN 組為43.6 ±2.2，而轉(zhuǎn)染 AS-miR-155組為18.9±1.8。AS-miR-155組穿膜細胞數(shù)明顯少于對照組和無義 ODN 組(F=598.212，P=0.000)。結(jié)果提示，下調(diào)miR-155表達后癌細胞的侵襲力受到明顯抑制。見圖2。

圖2 miR-155反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對癌細胞侵襲的影響(×100)

2.4 AS-miR-155轉(zhuǎn)染對癌細胞MMP-13水平的影響

ELISA結(jié)果顯示，空白對照組和無義ODN組MMP-13含量分別為(85.2±2.8)pg/mL和(84.8±2.5)pg/mL，而轉(zhuǎn)染 As-miR-155組 MMP-13含量為(35.6±1.5)pg/mL。AS-miR-155 組 MMP-13含量明顯小于對照組和無義ODN組(F=689.28，P=0.000)。結(jié)果提示，下調(diào)miR-155的表達可明顯抑制MMP-13的水平。

3 討論

微小RNAs是一類單鏈小分子RNA，長約20～24 nt。其特點為短序列、非編碼且具有調(diào)控力［1］，其對基因表達的反向調(diào)控主要是通過與靶基因完全或不完全互補結(jié)合完成。大量研究表明，多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與微小RNAs的異常表達有關(guān)［1－3］。微小RNAs的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為乳腺癌、大腸癌、甲狀腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤的基因診斷和治療提供了一個新的靶點。

侵襲、遷移與增殖是轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌治療失敗及預(yù)后不佳的最常見原因，也是腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移的重要步驟。因此，積極尋求與甲狀腺癌遷移和侵襲能力相關(guān)的分子標志物，探討其內(nèi)在發(fā)生及發(fā)展機制，對甲狀腺癌的診療水平的提高有極大幫助。研究數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，miR-155高表達與許多實體瘤如乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、胰腺導管腺癌等［4－7］的生物學表型密切相關(guān)。但在甲狀腺癌細胞遷移、侵襲中miR-155所起作用目前尚有待進一步明確。

本研究通過反義寡核苷酸下調(diào)miR-155的表達，結(jié)果顯示miR-155表達下調(diào)后的BCPAP細胞遷移速度變慢，穿過Transwell小室聚碳酸酯膜的能力明顯下降，與空白對照組及無義ODN組比較，差異有統(tǒng)計學意義。

細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分的降解是腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程。研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)能降解ECM。按照底物特異性，人類MMPs主要分為明膠酶、間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)溶解素、基質(zhì)溶解因子、基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)酶及其他6類。MMPs主要功能是降解一種或多種ECM成分;調(diào)控血管形成;通過與整合素的相互活化而加強細胞間的黏附作用。MMP-13是MMPs重要成員，許多學者發(fā)現(xiàn)，MMP-13在許多惡性腫瘤包括甲狀腺癌細胞中高表達［10－11］，且與甲狀腺癌侵襲有關(guān)［12］。本研究采用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，AS-miR-155轉(zhuǎn)染組MMP-13含量明顯低于空白對照組和無義ODN組。

本研究表明，下調(diào)miR-155表達水平，可使甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力得到明顯抑制。而MMP-13被抑制是miR-155調(diào)控甲狀腺癌細胞遷移和侵襲能力的重要機制之一。因此，miR-155在人甲狀腺癌細胞遷移侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，有望成為甲狀腺癌基因治療中頗具前景的候選靶點。

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