劉海波，盧小東，邵啟祥*

(1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.淮安市中心血站，江蘇淮安223001)

輸注血小板能有效預(yù)防和治療因血小板減少或血小板功能缺陷所引起的出血癥狀，但近年來隨著血小板成分輸注在臨床的逐步推廣和展開，血小板的輸血反應(yīng)不斷增多，特別是血小板輸注無效(platelet transfusion refractoriness，PTR)，目前已經(jīng)成為臨床輸血面臨的一大難題。其中尤以造血功能異常的血液科患者多見，且多數(shù)血小板減少或血小板功能異常的患者需長期依賴輸注血小板來預(yù)防出血［1］。為此，我們對血小板輸注無效的血液病患者進行抗血小板抗體檢測，并對部分患者進行了配合性血小板輸注，經(jīng)與隨機輸注者相比，效果提高顯著，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象

39份標本由淮安市第一人民醫(yī)院、淮安市第二人民醫(yī)院和淮安市第三人民醫(yī)院于2011年10月至2012年10月提供(新鮮血清或血漿樣本，3 000 r/min離心5 min，取上清液檢測)。39名患者中男22例，女17例，均為長期住院血液病患者，且輸注單采血小板≥5次，以往輸注未經(jīng)交叉配型的單采血小板后發(fā)生PTR均≥2次，并已排除感染、發(fā)熱、脾腫大和彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等非免疫因素［2］。

1.2 試劑與設(shè)備

固相凝集法檢測抗血小板抗體所用試劑及交叉配型試劑為長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，主要包含低離子強度溶液(氯化鈉、甘氨酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、試劑防腐劑);陽性對照(經(jīng)過處理效價為1∶64的臨床血小板抗體陽性患者血清或血漿);陰性對照(經(jīng)防腐除菌處理且無妊娠和輸血史的陰性AB型健康人血清);抗人IgG;指示紅細胞(0.35%O型 RhD陽性紅細胞)。批號分別為20100703和20110801。UNIVERSAL-32水平離心機為德國Hettich公司產(chǎn)品。日本三洋公司MIR-162恒溫孵育箱。

1.3 固相凝集法檢測抗血小板抗體

取3人份等比例混合O型血小板制備成血小板懸液，并向各反應(yīng)孔加入50 μL，輕拍10 s，置水平離心機50×g離心5 min固定。洗滌3次后向各孔加入100 μL低離子強度溶液，分別向相應(yīng)孔中加入50 μL患者樣本、陽性對照及陰性對照，37℃孵育30 min。洗滌5次后向各孔加入50 μL抗人IgG及50 μL指示紅細胞，輕拍后200×g離心30 min，將檢測孔與對照孔進行比較和判讀，其中陽性和弱陽性表示存在抗血小板抗體。

1.4 交叉配型

制備與患者ABO同型的單采血小板懸液，按照“1.3”步驟繼續(xù)操作，最后將檢測孔與對照孔進行比較和判讀，其中陽性和弱陽性表示血小板配型不合，陰性則相反。

1.5 單采血小板

由我站成分科單采室用MCS+和TRIMA血細胞分離機對健康獻血者機采制備而得。容量為250～300 mL/袋，血小板含量≥250×109/袋，保存期為 5 d［3］。

1.6 輸注評價

血小板輸注后計數(shù)增加，臨床出血停止或癥狀明顯改善則輸注有效;若血小板計數(shù)無上升，臨床出血癥狀也無好轉(zhuǎn)則為無效。由于患者出血癥狀改善程度不易量化，故目前常用輸注后校正血小板計數(shù)增加值(corrected count increment，CCI)或血小板恢復(fù)百分率進行判斷。本次試驗選取輸注后24 h患者外周血小板計數(shù)以及輸入的血小板數(shù)量，計算出24 h CCI作為判斷指標［4］，其計算公式如下:

其中，體表面積=0.006 1×身高(cm)+0.012×體質(zhì)量(kg)－0.015 29。若 24 h CCI＜4.5 ×109/L，則為 PTR。

2 結(jié)果

39例PTR患者樣本中檢出抗血小板抗體32例(82.1%)。32例經(jīng)血小板交叉配型后，有17例匹配成功，占樣本總量43.6%，另外15例隨機輸注血小板。

結(jié)果表明，經(jīng)配型輸注的17例患者中，血小板輸注有效15 例(88.2%)，24 h CCI均值為(9.05 ±3.11)×109/L;隨機輸注15例患者中，輸注有效僅3例(20.0%)，24 h CCI均值為(2.77 ±1.88)×109/L，經(jīng)χ2檢驗，配型輸注組輸注有效率明顯高于隨機輸注組(χ2=30.2，P ＜0.05)。

3 討論

在本次實驗中，39例PTR病例均嚴格按照輸血指征，由臨床醫(yī)生根據(jù)患者出血情況、血小板數(shù)量以及出血時間等作綜合判斷，一般在血小板＜(10～20)×109/L，特別是＜5×109/L時，給予預(yù)防性血小板輸注，以防顱內(nèi)出血等危象;血小板＜50×109/L，同時患者有活動性出血癥狀，給予治療性輸注。手術(shù)患者術(shù)前血小板調(diào)整至70×109/L以上，眼科、腦外科手術(shù)調(diào)整至100×109/L以上［5］。目前，臨床上使用的血小板大部分用于預(yù)防性輸注。

影響血小板最終輸注效果的因素包含免疫和非免疫兩個方面。其中，非免疫性因素約占到PTR總數(shù)的80%，包括血小板輸注劑量不足、感染、發(fā)熱、敗血癥、脾功能亢進以及DIC等。另外部分藥物如一些抗生素、抗真菌藥物、化療藥物、環(huán)孢素等，以及治療過程如全身照射(TBI)、靜脈閉塞病(VOD)、移植物抗宿主病(GVHD)等均會影響或破壞血小板功能［6］。本組39例PTR病例中，有7例最終未檢出血小板抗體，其輸注無效的原因可能仍與非免疫性因素相關(guān)。反復(fù)輸血或輸血小板的患者發(fā)生PTR多以免疫因素為主，主要是由于血小板制劑中混有一定量的紅細胞和白細胞，同時血小板自身除了存在血小板特異性抗原(human platelet antigens，HPA)外，還存在白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)和紅細胞抗原(ABH blood group antigens，ABH)，目前臨床只要求ABO同型輸注，一旦HLA和HPA不匹配，輸注后就會發(fā)生同種免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致 PTR［7］。

預(yù)防免疫性PTR主要有3種方法，一是輸注白細胞過濾后的血制品，包括血小板。白細胞過濾器可以去除原制品中99.9%的白細胞，因此可以延緩白細胞表面抗原引起的PTR。但血小板表面也存在HLA和HPA，因此對反復(fù)輸注的患者仍不能完全避免PTR的產(chǎn)生。二是建立HLA和HPA已知型血小板供者庫，對需要輸注血小板的患者預(yù)先檢測HLA和HPA分型，然后從供者庫中挑選匹配獻血者捐獻的血小板進行輸注，從而在根本上預(yù)防PTR。在國外，80%的PTR患者可以從50 000人的供者庫中找到5位HLA和HPA完全匹配的獻血者［8］，但是這樣大樣本的供者庫需要投入大量的人員、設(shè)施、設(shè)備及運營資金，只有在大型的血液中心和實力雄厚的醫(yī)院共同協(xié)作下才有可能實現(xiàn)。三是采用血小板抗體篩查和交叉配型的方法挑選匹配的血小板輸注［9］。目前，國內(nèi)外用于血小板免疫檢測的實驗方法主要有功能性試驗、酶免法、熒光法和固相凝集法等［10］。本次實驗采用的固相凝集法能同時檢測HLA抗體和HPA抗體，檢測性能與國外單克隆抗體固相血小板抗體實驗(MASPAT)試劑相當［11］，且操作簡捷，無需特殊的儀器設(shè)備，比較適應(yīng)各級采供血和醫(yī)療機構(gòu)的需求。

由于血小板捐獻數(shù)量有限，本次實驗對未能及時匹配者，仍采取隨機輸注的方式，輸注效果明顯低于配型輸注組。在實際工作中，要化解血源不足的問題，除進一步宣傳擴充單采供者隊伍外，也可以從技術(shù)層面上予以考慮，如可否將部分經(jīng)常捐獻者的血小板包被固定后加保護劑長期凍存，需要時隨時取出配用;一旦發(fā)現(xiàn)匹配供者立即招募采集等。我們將在今后的工作中進一步探索相關(guān)措施。

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