陳霞，袁國(guó)躍，王東，王瑩，李梅

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇鎮(zhèn)江212001)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，約占所有甲狀腺惡性腫瘤的60% ～70%，病理組織學(xué)和某些具有顯著的假乳頭結(jié)構(gòu)的良性乳頭狀增生性疾病不易鑒別，影響臨床診斷和治療。本研究通過對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)蛋白質(zhì)表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，以探討這兩種細(xì)胞因子在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 取江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2009年1月至2011年12月外科手術(shù)切除的甲狀腺標(biāo)本及存檔蠟塊共130例，經(jīng)組織病理明確診斷，其中甲狀腺乳頭狀癌50例，男10例，女40例，年齡17～73歲，中位年齡44歲;甲狀腺腺瘤50例，男10例，女40例，年齡14～73歲，中位年齡44歲;正常甲狀腺組織30例，男6例，女24例，年齡11～73歲，中位年齡47歲。

1.2 免疫組化染色

1.2.1 HSP27、TGF-β1檢測(cè) 采集標(biāo)本，甲醛固定，常規(guī)脫水透明、浸蠟、包埋，部分已為蠟塊包埋，連續(xù)切片，厚度約為4 μm，APES防脫玻片(北京金麥克公司)黏附，采用免疫組織化學(xué)法，分別對(duì)HSP27、TGF-β1進(jìn)行染色(兔抗人 HSP27 多克隆抗體、兔抗人TGF-β1多克隆抗體、免疫組化試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物有限公司)，采用已知陽(yáng)性對(duì)照片(購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.2 結(jié)果判斷 取染色效果較好的組織切片，避開腫瘤壞死及邊緣區(qū)域，在高倍視野下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用半定量積分法對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞率及陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別進(jìn)行分級(jí)記分。陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。同時(shí)根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分，不著色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度之積＞3分即為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。所得結(jié)果可分為4個(gè)等級(jí):(－)0～2分，(+)3～4分，(++)6～8分，(+++)9～12分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩樣本陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSP27、TGF-β1在3 種甲狀腺組織中的免疫組化結(jié)果

HSP27在正常甲狀腺組織中呈陰性表達(dá)或低表達(dá)，而在富于癌細(xì)胞的增生區(qū)高表達(dá)，免疫組化染色呈現(xiàn)棕黃或者棕褐色，對(duì)應(yīng)腫瘤周圍組織中僅見散在梭形細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)著色。TGF-β1在癌細(xì)胞的胞質(zhì)呈陽(yáng)性表達(dá)，富于癌細(xì)胞的增生區(qū)域尤為突出，免疫組化染色呈棕黃或者棕褐色，正常甲狀腺組織中呈陰性表達(dá)或低表達(dá)。見圖1。

圖1 HSP27、TGF-β1在3種甲狀腺組織中的免疫組化結(jié)果(×400)Fig 1 Immunohistochemistry results of HSP27、TGF-β1in different thyroid tissues

2.2 HSP27、TGF-β1在3 種甲狀腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率比較

甲狀腺乳頭狀癌組織與甲狀腺腺瘤組織相比，HSP27、TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.002，P ＜ 0.05;χ2=3.933 9，P ＜0.05);甲狀腺乳頭狀癌組織與正常甲狀腺組織相比，HSP27、TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.301 1，P ＜ 0.05;χ2=4.983 5，P ＜0.05);甲狀腺腺瘤組織和正常甲狀腺組織間的HSP27、TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.013 6，P ＞0.05;χ2=0.222 6，P ＞0.05)。見表 1。

表1 HSP27、TGF-β1蛋白在3種甲狀腺組織中的表達(dá)Tab 1 Expression of HSP27 and TGF-β1in different thyroid tissues

3 討論

正常組織細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)水平很低［1］。應(yīng)激狀態(tài)可致胞內(nèi)HSP27磷酸化并致其寡聚體解聚，HSP27表達(dá)上調(diào)［2］。HSP27在腫瘤發(fā)病中的作用與其對(duì)細(xì)胞的影響有關(guān)，它在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中可與相關(guān)活性蛋白相互作用并抑制凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制細(xì)胞凋亡［3］。對(duì)高度惡性甲狀腺疾病的研究發(fā)現(xiàn)，惡性甲狀腺疾病細(xì)胞系C-643中HSP27-1高表達(dá)，且這種高表達(dá)與HSP對(duì)HSP27-1表達(dá)基因啟動(dòng)子的活化直接有關(guān)［4］。本資料結(jié)果顯示HSP27在正常甲狀腺組織及甲狀腺腺瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率較低，而在甲狀腺乳頭狀癌中陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，表明HSP27的陽(yáng)性表達(dá)率高同樣與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病密切相關(guān)。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，人類激肽釋放酶2、早期前列腺癌抗原、尿激酶型纖溶酶原激活物/尿激酶型纖溶酶原激活物受體、TGF-β1、IL-6/IL-6受體的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些因子均可用于早期腫瘤的預(yù)測(cè)和腫瘤患者的病情判斷［5］。TGF-β1與其受體(如TGFβ1R1)結(jié)合后可抑制多種細(xì)胞增殖、分化并促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)形成［6］。且TGF-β1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)形成、腫瘤血管形成、細(xì)胞黏附和遷移以及抑制機(jī)體抗腫瘤免疫等作用［7］。在腫瘤細(xì)胞中，TGF-β1可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，利于腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［8］。這均說明TGF-β1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果中甲狀腺乳頭狀癌組織中TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織。另有研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺低分化癌DH-14-3細(xì)胞可表達(dá)IL-8、TGF-β1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-1和甲狀旁腺相關(guān)蛋白［9］，說明TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，HSP27和 TGF-β1在甲狀腺乳頭狀癌中陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高，可能是甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后判斷的重要生物學(xué)標(biāo)志物，可作為甲狀腺良惡性病變鑒別診斷及評(píng)估甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后的參考指標(biāo)。

［1］ Lelj-Garolla B，Mauk AG.Self-association of a small heat shock protein［J］.J Mol Biol，2005，345(3):631 －642.

［2］ Hayes D，Napoli V，Mazurkie A，et al.Phosphorylation dependence of hsp27 multimeric size and molecular chaperone function［J］.J Biol Chem，2009，284(28):18801－18807.

［3］ Tan CY，Ban H，Kim YH，et al.The heat shock protein 27(Hsp27)operates predominantly by blocking the mitochondrial-independent/extrinsic pathway of cellular apoptosis［J］.Mol Cells，2009，27(5):533 －538.

［4］ Mineva I，Gartner W，Hauser P，et al.Differential expression of alphaB-crystallin and Hsp27-1 in anaplastic thyroid carcinomas because of tumor-specific alphaB-crystallin gene(CRYAB)silencing［J］.Cell Stress Chaperones，2005，10(3):171 －184.

［5］ Vesprini D，Liu S，Nam R.Predicting high risk disease using serum and DNA biomarkers［J］.Curr Opin Urol，2013，23(3):252 －260.

［6］ Tany Y，Katuri V，Srinivasan R，et al.Transforming growth factor-beta suppresses nonmetastatic colon cancer throngh smad4 and adaptor protein ELF at an early stage of tumorigenesis［J］.Cancer Res，2005，65(10):4228 －4237.

［7］ Dabek J，Kulach A，Monastyrska-Cup B，et al.Transforming growth factor beta and cardiovascular diseases:the other facet of the'protective cytokine'［J］.Pharmacol Rep，2006，58(6):799 －805.

［8］ Sinpitaksakul SN，Pimkhaokham A，Sanchavanakit N，et al.TGF-beta1 induced MMP-9 expression in HNSCC cell lines via Smad/MLCK pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，371(4):713 －718.

［9］ Teshima J，Doi H，F(xiàn)ujimori K，et al.A human thyroid cancer cell line，DH-14-3，newly established from poorly differentiated thyroid carcinoma［J］.Tohoku J Exp Med，2013，230(2):75-82.