武耀輝 陳芝喜 趙 慧 何贊厚 陳津巖 李志強(qiáng)

廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510405）

強(qiáng)肌健力方是著名中醫(yī)專家鄧鐵濤教授治療脾胃虛損型重癥肌無(wú)力的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上應(yīng)用多年，其對(duì)脾胃虛損型重癥肌無(wú)力患者療效確切［1－2］，功能補(bǔ)脾益氣，強(qiáng)肌健力。本實(shí)驗(yàn)采用大黃復(fù)制脾虛模型，體外培養(yǎng)脾虛大鼠的主要免疫器官——胸腺細(xì)胞，用強(qiáng)肌健力方含藥血清進(jìn)行試驗(yàn)，用免疫組化方法觀察PCNA和Fas蛋白表達(dá)的變化，從蛋白表達(dá)角度來(lái)揭示強(qiáng)肌健力方的免疫學(xué)作用機(jī)理，為臨床治療脾胃虛損型的重癥肌無(wú)力提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 強(qiáng)肌健力方（由黃芪、黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、升麻、柴胡、陳皮、甘草組成）按照回流提取法煎煮，70℃水浴濃縮成3g／mL；大黃按1：5加入沸水煮沸12min，趁熱過(guò)濾，煎煮兩次，濾液合并濃縮成2g／mL（以上中藥均由廣州致信藥業(yè)提供，經(jīng)本校中藥學(xué)院鑒定）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠8周齡，雄性，體重200～220g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（粵）2008－0002。

1.3 主要試劑 增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒：由博士德生物有限公司提供，批號(hào)：20091200；FAS抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒：由博士德生物有限公司提供，批號(hào)：20100400；刀豆蛋白 A（ConA）由sigma公司提供，RPMI－1640培養(yǎng)基由吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 含藥血清的制備 大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)2d后，采用隨機(jī)法將9只動(dòng)物分為兩組，即①?gòu)?qiáng)肌健力方組（7只），灌服強(qiáng)肌健力方藥液2mL／200g，給藥劑量為23.4g／kg，1d1次，連續(xù)給藥5d；②正常血清對(duì)照組（2只），灌服等量的蒸餾水，1d1次，連續(xù)5d；在末次灌胃后1h，從眼眶靜脈叢穿刺取血，4℃靜置2h后，2000rpm離心10min，取血清，各組合并后在56℃水浴滅活30min；無(wú)菌條件下過(guò)濾除菌；－40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將RPMI－1640（含10%胎牛血清）培養(yǎng)液中加入含藥血清，體積分?jǐn)?shù)為10%（即10mL含藥血清加培養(yǎng)液至100mL）的為低含藥血清組；中20%，高30%依此類推，得到各濃度含藥血清組，即分別為：①Q(mào)JJL低血清組（10%）；②QJJL中血清組（20%）；③QJJL高血清組（30%）；④正常血清組（含正常大鼠血清為20%）；共4組血清。

2.2 脾虛胸腺細(xì)胞的分離培養(yǎng) 2.2.1 大鼠隨機(jī)分為2組，即脾虛模型組（15只），正常對(duì)照組（7只）。脾虛模型的復(fù)制參照文獻(xiàn)稍作修改［3］，脾虛模型組每天灌服200%的大黃水煎液2mL／200g，連續(xù)20d；正常對(duì)照組每天灌服蒸餾水2mL／200g，連續(xù)20d。

2.2.2 將脾虛模型組大鼠頸椎脫臼處死，立即放入75%酒精中浸泡消毒3～5min，在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌條件下取出胸腺。胸腺組織用PBS液沖洗1次，在器皿中用眼科剪將其粗略剪成小塊，用無(wú)菌毛玻璃磨碎，于不銹鋼網(wǎng)200目過(guò)濾，1640同時(shí)不斷沖洗，得到的細(xì)胞液，800rpm離心8min后液體棄上清液，取細(xì)胞層，依次加純水和高滲鹽水破裂紅細(xì)胞，PBS液洗2遍。臺(tái)盼藍(lán)染色液法檢測(cè)細(xì)胞的活力＞90%。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及指標(biāo)測(cè)定 隨機(jī)將脾虛模型大鼠的原代胸腺細(xì)胞分為五組，即①Q(mào)JJL低血清組（10%），②QJJL中血清組（20%），③QJJL高血清組（30%），④胎牛血清組（20%胎牛血清），⑤正常血清組（正常大鼠血清20%）。重懸于RPMI－1640含藥完全培養(yǎng)基的細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔加1mL細(xì)胞懸液，即細(xì)胞數(shù)為4×107個(gè)，再分別加入含①～⑤血清培養(yǎng)液1mL，每孔加入ConA，濃度為10ug／mL，培養(yǎng)72h后分離細(xì)胞，吸取細(xì)胞上清液保存，余留細(xì)胞用50uLPBS液調(diào)均濃度，取10uL／片涂片，做免疫組化觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均以（±s）表示，組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3.1 胸腺細(xì)胞PCNA表達(dá)比較 結(jié)果顯示：QJJL中血清組胸腺細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)增多，表達(dá)細(xì)胞陽(yáng)性面積、陽(yáng)性面積率、累積光密度均明顯高于胎牛血清組、正常血清組（均P＜0.01）；QJJL中血清組與QJJL低血清組、QJJL高血清組比較，細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)均顯著增多（均P＜0.01）。PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色。QJJL中血清組染色較深，細(xì)胞核和胞漿均染色，大多為棕褐色；QJJL低、高血清組也有染色；正常血清組和胎牛血清組染色細(xì)胞數(shù)目少，染色輕微。見表1、圖1。

表1 各組胸腺細(xì)胞PCNA表達(dá)比較（±s）

表1 各組胸腺細(xì)胞PCNA表達(dá)比較（±s）

注：與胎牛血清組比較△P＜0.01；與正常血清組比較▲P＜0.01，與QJJL低血清組比較◇P＜0.01；與QJJL高血清組比較◆P＜0.05

組別 n（視野） 陽(yáng)性面積 陽(yáng)性面積率（＊100） 累積光密度QJJL低血清組15 3810±666 1.240±0.217 1199.7±209.6 QJJL中血清組 15 6761±2129△▲◇◆ 2.201±0.693△▲◇◆ 2129.0±670.5△▲◇◆QJJL高血清組 15 3609±955 1.175±0.311 1136.4±300.7胎牛血清組 15 2100±428 0.684±0.139 661.2±134.8正常血清組15 2552±596 0.831±0.194 803.7±187.7

圖1 各組胸腺細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)比較（SABC法，×400倍）

3.2 胸腺細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)比較 結(jié)果顯示：QJJL中血清組胸腺細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)細(xì)胞陽(yáng)性面積、陽(yáng)性面積率、累積光密度均顯著低于胎牛血清中、正常血清組（P＜0.01－0.05）；QJJL中血清組與QJJL低血清組、QJJL高血清組比較，胸腺細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)均顯著減少（均P＜0.01）。Fas蛋白主要定位于細(xì)胞漿中，少數(shù)胞膜著色，細(xì)胞膜及細(xì)胞漿呈棕黃色為Fas陽(yáng)性細(xì)胞。QJJL中血清組染色很少，也很淺，其余組別胞膜和胞漿染色的細(xì)胞明顯增多。見表2、圖2。

表2 各組胸腺細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組胸腺細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與胎牛血清組比較△P＜0.01；與正常血清組比較▲P＜0.01；與QJJL低血清組比較◇P＜0.01；與QJJL高血清組比較◆P＜0.05

組別 n（視野） 陽(yáng)性面積 陽(yáng)性面積率（＊100） 累積光密度QJJL低血清組15 4001±546 1.303±0.178 1260.2±172.0 QJJL中血清組 15 2258±398△▲◇◆ 0.735±0.130△▲◇◆ 711.1±125.5△▲◇◆QJJL高血清組 15 3088±811 1.005±0.264 972.4±255.3胎牛血清組 15 2904±540 0.945±0.176 914.6±170.1正常血清組15 6449±925 2.100±0.301 2030.9±291.2

圖2 各組胸腺細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)比較（SABC法，×400倍）

4 討 論 免疫系統(tǒng)包括中樞免疫器官和外周免疫器官，中樞免疫器官是免疫細(xì)胞產(chǎn)生、成熟和分化的場(chǎng)所，胸腺屬于中樞免疫器官。胸腺是最先產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的器官，它是免疫系統(tǒng)發(fā)育和執(zhí)行功能的中樞。胸腺并不直接參與免疫應(yīng)答，但它提供T細(xì)胞發(fā)育成熟所必需的微環(huán)境［4］。胸腺還具有胸腺屏障的功能，可以防止外來(lái)的和隨血液的病原體及抗原異物穿過(guò)血管壁進(jìn)入胸腺實(shí)質(zhì)內(nèi)，以避免引起肌肉交接處乙酰膽堿受體的自身免疫抗體，防止破壞神經(jīng)后突觸膜和阻礙其信息傳導(dǎo)，引發(fā)重癥肌無(wú)力等癥。

PCNA是真核生物DNA合成所必須的一種相對(duì)分子量為36KD的酸性核蛋白，為DNA聚合酶的推動(dòng)因子［5］。PCNA和細(xì)胞周期蛋白Cyclin D是一對(duì)細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子，許多細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)二者的結(jié)合，PCNA其表達(dá)程度放映了細(xì)胞增殖活性的高低，是反映細(xì)胞增殖情況應(yīng)用最普遍的抗原標(biāo)記。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是生物體內(nèi)存在的一種普遍現(xiàn)象，它與細(xì)胞壞死不同，它不是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是更好的適應(yīng)生存環(huán)境而采取的主動(dòng)死亡過(guò)程，它通過(guò)凋亡清除體內(nèi)多余的或衰老的細(xì)胞，對(duì)于維持體內(nèi)組織細(xì)胞的平衡和穩(wěn)定具有重要作用。Fas抗原表達(dá)于多種類型的細(xì)胞表面，其配體主要表達(dá)于活化的淋巴細(xì)胞，二者的結(jié)合能迅速啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。已知Fas與FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對(duì)免疫系統(tǒng)的發(fā)育和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)具有重要的作用。細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控下進(jìn)行的主動(dòng)有序的死亡過(guò)程，其中Fas／Fas配體（FasL）途徑在凋亡發(fā)生中發(fā)揮重要作用。從T細(xì)胞釋放出來(lái)的FasL分子，既可以殺傷自已，也可以引起其它T細(xì)胞死亡，最后還可損傷被活化的B細(xì)胞，因?yàn)楹笳呒せ詈罂杀磉_(dá)Fas分子，結(jié)果細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答同時(shí)受到下調(diào)［6－9］。

強(qiáng)肌健力方是鄧?yán)吓R證治療脾胃虛損型重癥肌無(wú)力的經(jīng)驗(yàn)方藥，脾為后天之本，主四肢肌肉、主運(yùn)化，胃主受納；脾胃虛弱，氣血生化不足，無(wú)以生肌，四肢不得稟水谷之氣，故出現(xiàn)四肢肌肉萎縮，肌肉無(wú)力。該方取“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”之意，在補(bǔ)中益氣湯基礎(chǔ)上重用黃芪為君，輔以黨參、當(dāng)歸、白術(shù)、甘草等，具有補(bǔ)脾益損、強(qiáng)肌健力的功效［10］。強(qiáng)肌健力方含藥血清對(duì)脾虛胸腺細(xì)胞的補(bǔ)益作用如何，是刺激還是抑制細(xì)胞的增殖呢？

本實(shí)驗(yàn)中，QJJL低、中、高三組含藥血清的PCNA蛋白表達(dá)均明顯增多，尤其是QJJL中血清組最顯著（P＜0.01），說(shuō)明此組DNA合成和細(xì)胞增殖最為明顯；各組含藥血清組的Fas蛋白凋亡表達(dá)很少，尤其是QJJL中血清組染色很少，也很淺；正常血清組和胎牛血清組Fas蛋白凋亡表達(dá)顯著增多，陽(yáng)性染色也比較明顯。強(qiáng)肌健力方可以促進(jìn)胸腺細(xì)胞修復(fù)、分化成熟，進(jìn)而促使其增殖，蛋白合成增加，從而起到胸腺組織的修復(fù)和保護(hù)作用，這與課題組前期實(shí)驗(yàn)報(bào)道的強(qiáng)肌健力口服液能促進(jìn)DNA合成的結(jié)果相符［11－13］，F(xiàn)as蛋白抗原表達(dá)明顯與機(jī)體免疫力呈負(fù)相關(guān)性，這說(shuō)明強(qiáng)肌健力方能促進(jìn)胸腺細(xì)胞修復(fù)損傷，延緩細(xì)胞凋亡。而且，QJJL中血清組最為顯著，說(shuō)明這個(gè)強(qiáng)肌健力方20%血藥濃度也許是機(jī)體最佳濃度，刺激細(xì)胞修復(fù)和增殖最為明顯，進(jìn)一步說(shuō)明的中醫(yī)組方的精妙，也為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床上口服藥和注射劑等用藥量。

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