甄海寧 河井信行 岡田真樹(shù) 大久保修一 田宮隆 章翔 劉衛(wèi)平 霍軍麗 費(fèi)舟

腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)有賴(lài)于活躍的能量代謝和大量的蛋白合成，而蛋白合成則需要充足的氨基酸供給[1]。大型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（large-type amino acid transporter 1,LAT1）和細(xì)胞表面抗原4F2重鏈（4F2 heavy chain,4F2hc）可共價(jià)結(jié)合形成異源二聚體，以介導(dǎo)分枝型或芳香族必需氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，LAT1/4F2hc復(fù)合物是一種大型、中性氨基酸的主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體[2]。近年來(lái)有關(guān)資料顯示LAT1和4F2hc高表達(dá)與人類(lèi)多種類(lèi)型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。為此，本研究采用免疫組化方法檢測(cè)了LAT1和4F2hc在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)狀況，并進(jìn)一步分析了其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別、惡性程度以及二者表達(dá)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 62例腦膠質(zhì)瘤患者為日本香川大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬醫(yī)院腦神經(jīng)外科自1995年10月至2010年2月收治的病例，男、女各31例，年齡3～89歲，平均（51.4±18.0）歲。腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，按WHO 2007年分類(lèi)和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，包括Ⅰ級(jí)4例，均為毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤；Ⅱ級(jí)14例，包括彌漫型星形細(xì)胞瘤6例，纖維型星形細(xì)胞瘤4例，肥胖細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤2例，少突星形細(xì)胞瘤1例，室管膜瘤1例；Ⅲ級(jí)13例，包括間變型星形細(xì)胞瘤12例，間變型室管膜瘤1例；Ⅳ級(jí)31例，均為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。低惡性度膠質(zhì)瘤（包括Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)）18例，高惡性度膠質(zhì)瘤（包括Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)）44例。蠟塊連續(xù)切片，厚3μm。

1.2 免疫組化方法 采用聚合物-過(guò)氧化物酶（PP）免疫組化兩步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，對(duì)于LAT1檢測(cè)，將切片浸于0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（PH 6.0）中，行微波（500W）抗原修復(fù)10min；對(duì)于4F2hc檢測(cè)，無(wú)需抗原修復(fù)。切片用0.3%H2O2于室溫下孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。用3%牛血清白蛋白（BSA）于室溫下孵育30min，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗稀釋度分別為：LAT1（日本Trans Genic）1:12.5，4F2hc（日本 Trans Genic）1:8。EnVision+/HRP 復(fù)合物液（丹麥Dako）于室溫下孵育40min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染。分別以LAT1和4F2hc表達(dá)陽(yáng)性的肺癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 LAT1和4F2hc在瘤細(xì)胞中的染色情況參照Nawashiro等[3]的方法，根據(jù)染色細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度兩個(gè)方面評(píng)定為-～+++。即在瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)最強(qiáng)的區(qū)域，于高倍視野（×400）下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性率≤50%為散在性染色，>50%為彌漫性染色。染色強(qiáng)度根據(jù)多數(shù)細(xì)胞的反應(yīng)分為陰性、弱染色和強(qiáng)染色。瘤細(xì)胞染色分級(jí)為：無(wú)染色或弱散在性染色（-）、弱彌漫性染色（+）、強(qiáng)散在性染色（++）、強(qiáng)彌漫性染色（+++）。LAT1和4F2hc在血管內(nèi)皮中的染色情況根據(jù)陽(yáng)性微血管數(shù)（NMV）亦評(píng)定為-～+++。即在血管內(nèi)皮免疫反應(yīng)最強(qiáng)的區(qū)域，于高倍鏡（×200）下觀察3～5個(gè)視野，其平均NMV≤1為無(wú)染色血管（-）、130為豐富的染色血管(+++)。以LAT1和4F2hc在瘤細(xì)胞或在微血管中的最高染色等級(jí)作為該病例最終的LAT1和4F2hc免疫反應(yīng)評(píng)級(jí)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，LAT1和4F2hc表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別、患者性別和年齡的關(guān)系以及二者表達(dá)之間的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析；LAT1和4F2hc在高、低不同惡性程度膠質(zhì)瘤間表達(dá)水平的差異采用χ2檢驗(yàn)。檢測(cè)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LAT1和4F2hc的定性和定位表達(dá) LAT1和4F2hc在62例膠質(zhì)瘤中均有不同程度的表達(dá)，其免疫陽(yáng)性信號(hào)既定位于瘤細(xì)胞內(nèi)也定位于血管內(nèi)皮；二者在瘤細(xì)胞內(nèi)的免疫染色主要位于胞漿和胞質(zhì)膜，少量位于胞核；而在鄰近腫瘤的11例正常腦組織中二者僅有可忽略不計(jì)的表達(dá)（圖1）。

圖1 LAT1和4F2hc在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。A：LAT1在毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（WHOⅠ級(jí)）血管內(nèi)皮中弱表達(dá)（+）；B：LAT1在肥胖細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級(jí)）血管內(nèi)皮中弱表達(dá)（+）；C：LAT1在間變型星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ級(jí)）血管內(nèi)皮中中等強(qiáng)度表達(dá)以及在瘤細(xì)胞胞漿中弱表達(dá)（++；D：LAT1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級(jí)）血管內(nèi)皮中強(qiáng)表達(dá)以及在瘤細(xì)胞胞漿中中等強(qiáng)度表達(dá)（+++）；E：LAT1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級(jí)）瘤細(xì)胞胞漿和血管內(nèi)皮中強(qiáng)表達(dá)（+++）；F：LAT1在鄰近腫瘤的正常腦組織中無(wú)明顯表達(dá)；G：4F2hc在毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（WHOⅠ級(jí)）胞漿中弱表達(dá)（+）；H：4F2hc在肥胖細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級(jí)）瘤細(xì)胞胞漿中中等強(qiáng)度表達(dá)以及在血管內(nèi)皮中弱表達(dá)（++）；I：4F2hc在間變型星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ級(jí)）胞漿和胞質(zhì)膜中強(qiáng)表達(dá)（+++）；J：4F2hc在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級(jí)）胞漿和胞質(zhì)膜中強(qiáng)表達(dá)以及在血管內(nèi)皮中中等強(qiáng)度表達(dá)（+++）；K：4F2hc在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級(jí)）胞漿、胞質(zhì)膜、胞核以及血管內(nèi)皮中強(qiáng)表達(dá)（+++）；L：4F2hc在鄰近腫瘤的正常腦組織中無(wú)明顯表達(dá)。A和G、B和H、C和I、D和J、E和K、F和L分別為同一組織標(biāo)本（×400，標(biāo)尺=20μm）

2.2 LAT1表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系LAT1免疫染色強(qiáng)度隨膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的升高而明顯增強(qiáng)（rs=0.526,P＜0.01），其在高惡性度膠質(zhì)瘤中的染色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于低惡性度膠質(zhì)瘤（χ2=42.456,P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.3 4F2hc表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系4F2hc免疫染色強(qiáng)度隨膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的升高而明顯增強(qiáng)（rs=0.413,P＜0.01），其在高惡性度膠質(zhì)瘤中的染色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于低惡性度膠質(zhì)瘤（χ2=40.026,P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 LAT1和4F2hc在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

2.4 LAT1和4F2hc表達(dá)之間的關(guān)系 LAT1和4F2hc表達(dá)水平存在明顯正相關(guān)（rs=0.319,P＜0.05）。

3 討論

LAT1和4F2hc分別由SLC7A5（solute carrier family 7 member 5）和SLC3A2基因編碼，二者蛋白產(chǎn)物可以二硫鍵共價(jià)結(jié)合形成異源二聚體，即LAT1/4F2hc復(fù)合物，亦稱(chēng)CD98，是一種大型、中性氨基酸的主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可介導(dǎo)多種分枝型或芳香族必需氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、組氨酸等[2]。近年來(lái)有關(guān)資料顯示LAT1和4F2hc高表達(dá)與人類(lèi)多種類(lèi)型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4-8]。

LAT1和4F2hc在人膠質(zhì)瘤中的表達(dá)研究目前國(guó)外僅有個(gè)別報(bào)道，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。Nawashiro等[3]采用免疫組化方法檢測(cè)60例膠質(zhì)瘤，包括Ⅱ級(jí)（纖維型星形細(xì)胞瘤）15例，Ⅲ級(jí)（間變型星形細(xì)胞瘤）17例，Ⅳ級(jí)（膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）28例。結(jié)果顯示LAT1和4F2hc在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中均有表達(dá)，而在腫瘤鄰近的正常腦組織中無(wú)明顯表達(dá)；LAT1表達(dá)隨膠質(zhì)瘤病理級(jí)別升高而明顯增強(qiáng)，4F2hc表達(dá)有隨膠質(zhì)瘤病理級(jí)別升高而增強(qiáng)的趨勢(shì)。Kobayashi等[9]采用Western blot方法檢測(cè)23例膠質(zhì)瘤，結(jié)果顯示LAT1有隨膠質(zhì)瘤惡性度增高而表達(dá)增強(qiáng)的趨勢(shì)，即在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（9/12）和間變型星形細(xì)胞瘤（6/8）中其表達(dá)陽(yáng)性率均為75%，而在彌漫型星形細(xì)胞瘤中其表達(dá)陽(yáng)性率僅為33%（1/3），且在3例正常腦組織中均無(wú)表達(dá)；采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法檢測(cè)11例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和7例間變型星形細(xì)胞瘤顯示均有4F2hc mRNA的明顯表達(dá)，而在1例正常腦組織和正常的人星形細(xì)胞中僅有微弱的表達(dá)。本研究結(jié)果與上述研究報(bào)道結(jié)果基本一致，也顯示LAT1和4F2hc在腦膠質(zhì)瘤中存在過(guò)表達(dá)，而在正常腦組織中二者僅有微弱的表達(dá)；不僅同樣證實(shí)了LAT1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)密切相關(guān)，而且證實(shí)了4F2hc表達(dá)也與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)密切相關(guān)，這提示LAT1和4F2hc共表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展存在密切關(guān)系。

Nawashiro等[3]報(bào)道LAT1和4F2hc的免疫陽(yáng)性信號(hào)主要定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞質(zhì)膜和胞漿，并未報(bào)道二者免疫陽(yáng)性信號(hào)在瘤組織血管內(nèi)皮中的定位。本研究證實(shí)LAT1和4F2hc不僅表達(dá)于人腦膠質(zhì)瘤瘤細(xì)胞內(nèi)，而且表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮。這提示LAT1和4F2hc高表達(dá)不僅在從瘤細(xì)胞間液向瘤細(xì)胞內(nèi)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，而且在氨基酸透過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn)入腫瘤細(xì)胞間質(zhì)過(guò)程中同樣發(fā)揮重要作用。以前的有關(guān)研究顯示，LAT1和4F2hc確實(shí)表達(dá)于小鼠、大鼠和牛等動(dòng)物腦組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并指出二者這種表達(dá)定位對(duì)于介導(dǎo)大型、中性氨基酸穿越血腦屏障（BBB）具有重要意義[10]，以上相關(guān)研究可為本研究結(jié)果提供間接的有力支持。如前文所述，LAT1和4F2hc在本組膠質(zhì)瘤中表達(dá)密切相關(guān)，但二者在瘤組織中的表達(dá)定位強(qiáng)度并非完全平行一致，即總體而言LAT1在血管內(nèi)皮中的表達(dá)要強(qiáng)于瘤細(xì)胞，而4F2hc在瘤細(xì)胞中的表達(dá)要強(qiáng)于血管內(nèi)皮，這提示LAT1和4F2hc表達(dá)存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明，4F2hc共可與6個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體亞單位共價(jià)結(jié)合形成異源二聚體而發(fā)揮包括中性、堿性和酸性多種氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用，即除了隸屬L系統(tǒng)的LAT1外，4F2hc還可與L系統(tǒng)的LAT2、y+L系統(tǒng)的y+LAT-1和y+LAT-2、asc系統(tǒng)的asc-1以及xc-系統(tǒng)的xCT（x-C-type transporter）亞單位結(jié)合[2]，這可以解釋4F2hc在瘤細(xì)胞中有相對(duì)于LAT1更高的表達(dá)。而4F2hc在血管內(nèi)皮中的表達(dá)相對(duì)于LAT1較低，提示這可能是氨基酸穿越血腦屏障的一種限速機(jī)制[10]。Nawashiro等[3]報(bào)道LAT1免疫陽(yáng)性信號(hào)也少量定位于瘤細(xì)胞胞核，但作者分析這是染色造成的偽影所致。本研究顯示LAT1和4F2hc免疫染色在瘤細(xì)胞中的確主要定位于胞質(zhì)和胞質(zhì)膜，但也少量定位于瘤細(xì)胞胞核。我們認(rèn)為L(zhǎng)AT1和4F2hc在瘤細(xì)胞胞核中的著色是特異性的，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究結(jié)果提示LAT1和4F2hc在人腦膠質(zhì)瘤中存在過(guò)表達(dá)，并且其高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)和惡性程度密切相關(guān)，二者在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

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