楊嫻 藍琳芳 邢世會 曾進勝 范玉華

腦白質病變（white matter lesions，WML）又稱腦白質改變（white matter changes,WMC），曾經也被稱為白質疏松（leukoaraiosis）,影像學上表現(xiàn)為腦室周圍或皮質下半卵圓中心區(qū)存在CT上的白質斑片狀或彌漫性低密度灶，或MRI T2加權圖像的高信號改變。其可以增加腦卒中、認知障礙、癡呆和死亡的風險。高齡和高血壓是最重要的危險因素。然而，作為可以被干預的危險因素——高血壓導致WML的有關機制尚未闡明。目前，血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)破壞被認為與WML發(fā)病有關[1-3]。BBB最重要的結構是毛細血管內皮細胞的緊密連接（tight junction,TJ），TJ在高血壓性WML中的變化及其促成腦白質病變的機制研究國內外均少有報道。原因方面是目前用于研究WML的動物模型包括雙側頸動脈狹窄模型[4-5]及自發(fā)性高血壓易卒中大鼠（spontaneously hyperten?sive stroke prone，SHRSP）[6-7]，均仍存在很大的不足之處。易卒中型腎血管性高血壓大鼠（strokeprone renalvascular hypertensive rats,RHRSP）的研究在高血壓后不同時間腦組織學檢查發(fā)現(xiàn)大鼠存在腦白質組織疏松和腔隙病灶[8]，這一動物模型中WML的發(fā)病與人類發(fā)病過程均有高血壓的基礎。因此，我們的研究采用RHRSP模型，觀察腦白質病理改變及探討高血壓所致TJ損壞在高血壓性WML發(fā)病中可能的機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康雄性SD大鼠90只，體質量60～90 g,由廣東省實驗動物中心提供。隨機分為假手術組和高血壓4周、8周、12周、20周、30周組，每組15只。

1.2 易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）模型制作與血壓測量 按已定型的雙腎雙夾法[8]復制RHRSP。假手術組未鉗夾腎動脈。不同時間點用ML866 Powerlab 4/30型大鼠血壓計（AD Instru?ments Pty Ltd，澳大利亞）經尾動脈測定收縮壓。

1.3 WML分級 10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后經左心室向主動脈插管，剪開右心房，快速灌注4℃生理鹽水100mL，至右心房流出清澈無血性液體后再以200mL 4%多聚甲醛+0.1mmol/L PBS溶液（pH7.4，4℃）固定腦組織，開顱取腦，后固定24 h，梯度蔗糖脫水；OCT包埋后行冰凍切片，片厚10μm，HE染色光鏡檢查進行腦白質病變分級，評估腦白質的4個區(qū)域：胼胝體、尾核、外囊、內囊；分級參照Wakita等[9]分級法，即0級：正常；1級：神經纖維纏結；2級：明顯的空泡形成；3級：有髓神經纖維消失。

1.4 透射電鏡觀察TJ 大鼠麻醉后，經左心室向主動脈插管，剪開右心房，快速灌注4℃生理鹽水100mL，再以2%多聚甲醛、2.5%戊二醛混合液500mL灌注后開顱取腦，將腦白質胼胝體取出并置于后固定液中。按照標準的電鏡操作過程制作半薄、超薄切片，鈾鉛雙染后在80 kV條件下用JEM-1200EX型透射電鏡觀察血腦屏障超微結構改變情況。

1.5 間接免疫熒光檢測白蛋白滲出 枸櫞酸中抗原修復,正常兔血清室溫孵育90 min。濾紙吸干封閉血清,滴加經抗體稀釋液稀釋的綿羊抗albumin抗體（LSBio），4℃濕盒孵育過夜。0.01 mol PBS(pH7.4)漂洗 5 min×3 次，滴加 FITC標記兔抗綿羊二抗（Bioworld），避光孵育60 min，漂洗5 min×3次，抗熒光淬滅封片，熒光顯微鏡觀察并照相。

1.6 Loyez神經纖維染色 冰凍切片放入4%鐵明礬水溶液24 h,多次蒸餾水洗，用新配的碳酸鋰蘇木素染液染24 h,0.5%鹽酸乙醇分化10 s,充分流動水洗，使之返藍。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 RHRSP模型血壓監(jiān)測結果 RHRSP血壓逐漸升高。與假手術組比較，術后4周、8周、12周、20周、30周組血壓明顯升高（P＜0.05）；模型組術后4周、8周血壓較前明顯升高（P＜0.01），而術后12周、20周、30周血壓差異不明顯（P＞0.05），12周后血壓趨于平穩(wěn)（表1）。

2.2 WML分級 RHRSP模型組WML隨著時間延長加重。胼胝體、尾核、外囊、內囊區(qū)域都可觀察到相應病理變化。與假手術組相比，術后4周開始出現(xiàn)輕度的病變（P＞0.05），8周始胼胝體病變明顯（P＜0.05），隨后加重，尾核、外囊、內囊逐漸受累；術后組間比較，20周時胼胝體病變較前顯著（P＜0.05），其余3個區(qū)域在各個時間點均較前沒有顯著差異；病變最明顯的部位在胼胝體（表2）。

2.3 BBB超微結構觀察 假手術組TJ完整，血管形態(tài)平滑。RHRSP4周及8周組相鄰內皮細胞間吻合緊密，TJ連續(xù)；12周時27個TJ中8個連續(xù)性破壞，基底膜增厚；20周時24個TJ中9個連續(xù)中斷，血管明顯扭曲，細胞器明顯腫脹，細胞內空泡形成；30周時20個TJ中有11個斷裂（圖1）。

2.4 腦白質白蛋白漏出間接免疫熒光結果RHRSP 4周、8周、12周組腦實質及血管周圍未見血漿白蛋白漏出；20周組胼胝體可見吞噬白蛋白的膠質細胞，血管周圍白蛋白熒光增強；30周組可見顆粒狀白蛋白漏出，遍及腦實質，白質區(qū)域以胼胝體及尾核漏出最明顯，血管周圍白蛋白漏出較前減少（圖2）。

2.5 Loyez神經纖維染色結果 Loyez神經纖維染色顯示假手術組大鼠神經纖維排列整齊、緊密。與假手術比較，RHRSP 4周組腦白質神經纖維排列整齊；8周組出現(xiàn)纖維紊亂；12周組可見空泡形成；20周組腦白質可見明顯的疏松，神經纖維纏結、斷裂；30周組疏松較前加重（圖3）。腦白質疏松最明顯的區(qū)域在胼胝體。

表1 RHRSP不同時間點血壓（mmHg）變化情況

表2 不同時間點腦白質病變分級結果

圖1 血腦屏障超微結構形態(tài)改變（46000×） A：RHRSP 4周組相鄰內皮細胞間吻合緊密，緊密連接連續(xù)(▼示）；B：RHRSP 8周組緊密連接完整（▼示）；C：RHRSP 12周組緊密連接連續(xù)性中斷（?示）；D：RHRSP 20周組緊密連接連續(xù)性中斷（?示），血管明顯扭曲；E：RHRSP 30周組緊密連接斷裂（?示）F：假手術組緊密連接完整連續(xù)（▼示）

圖3 Loyez神經纖維染色觀察（200×）A:RHRSP 4周組神經纖維排列整齊B：RHRSP 8周組神經纖維排列紊亂C：RHRSP 12周組神經纖維排列紊亂，空泡形成（?示）D：RHRSP 20周組腦白質明顯疏松，神經纖維纏結、斷裂（?示）E:RHRSP 30周組腦白質疏松較前加重（?示）F：假手術組神經纖維排列緊密、整齊

3 討論

WML是影像學診斷，對55歲以上的無神經精神癥狀的健康老年人行MRI檢查，發(fā)現(xiàn)13.9%存在3級以上的重度WML[10]。其病理學上表現(xiàn)為髓鞘脫失、星形膠質細胞增殖、小膠質細胞激活。它既反映了正常老齡化過程中的神經退行性改變，又存在與不同程度的小血管病變相聯(lián)系的病理改變,日益得到重視。

國外常采用雙側頸動脈狹窄模型研究WML，但與人類的發(fā)病過程相差甚遠，完全沒有考慮到年齡和血壓的影響。SHRSP雖然接近人類的生理，但是來源少，價格貴，限制了其應用。深入探討WML發(fā)病機制，需要找到更適用的動物模型。RHRSP常被應用于腦卒中研究，而我們發(fā)現(xiàn)，RHRSP也是適用的WML動物模型，首先，通過夾閉雙側腎動脈誘導的慢性進行性高血壓，進而誘發(fā)腦白質病變，與人類的發(fā)病過程，即慢性高血壓性腦白質病變發(fā)病過程相似；其次，病理染色顯示病程中出現(xiàn)腦白質疏松、膠質細胞增生、神經纖維纏結、缺失，與WML病理改變相符。我們的模型中病變最明顯的部位在胼胝體，這與雙側頸動脈狹窄模型一致[11]，考慮與此區(qū)域供血血管來自于脈絡膜動脈或豆紋動脈終末支，與來源于大腦表面的血管相互之間的吻合稀疏或缺如有關。因此，當發(fā)生腦缺血或低灌注時，該區(qū)域極易發(fā)生缺血性改變。

高齡和高血壓是腦白質病變發(fā)病最重要的危險因素。高血壓患者中，腦血管阻力增大、腦血管自動調節(jié)功能下降與WML嚴重性相關[12]，腦血流動力學的改變參與WML形成。本研究中高血壓12周前血壓升高迅速，卻未見明顯病變，12周后血壓相對平穩(wěn),此后才出現(xiàn)明顯的病變。推測單純高血壓并不一定會造成大鼠WML，至少要12周后，血管內皮受到一定程度損傷，通過系列病理變化，才會出現(xiàn)明顯的WML。綜合病變分級，我們的研究支持高血壓與WML密切相關，可以促成其發(fā)生發(fā)展。這為臨床上對伴有高血壓的患者必須合理控制血壓提供依據。

BBB嚴格調控腦內微環(huán)境。腦白質缺血損害患者腦脊液白蛋白數量明顯增加[13]，而腦脊液白蛋白指數是BBB受損的一個標記，提示白蛋白通過受損的BBB滲漏到腦脊液中。動物實驗發(fā)現(xiàn)通過雙側頸動脈狹窄制備的大鼠WML模型出現(xiàn)明顯BBB破壞[11,14]。夾閉單側頸總動脈的SHRSP模型術后出現(xiàn)明顯IgG滲漏伴出血，提示屏障的損壞[15]。病理學研究還發(fā)現(xiàn)內皮細胞激活和因此而導致的BBB破壞是腦小血管病包括腦白質病變在內的主要特征[16]。BBB破壞后，一些大分子物質包括蛋白、細胞因子等進入血管壁、血管周圍間隙以及腦組織造成功能損害和毒性，可能是WML的發(fā)病機制[17]?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）作為內肽酶家族的一員，有下調細胞外基質的作用，其中MMP-2在慢性腦內低灌注狀態(tài)下BBB的破壞中起著重要的作用，雙側頸動脈狹窄大鼠通過腹腔注射MMP-2抑制劑AG3340及對MMP-2基因敲除的小鼠進行觀察發(fā)現(xiàn)抑制MMP-2的表達可以通過減輕BBB破壞，進而改善WML[18]。研究表明可以用放射示蹤劑及大分子標記物如辣根過氧化物酶或伊文氏藍檢測BBB滲漏，而我們采用直接的白蛋白免疫熒光，發(fā)現(xiàn)病程中出現(xiàn)明顯的白蛋白漏出且逐漸增多，并且發(fā)現(xiàn)吞噬白蛋白的膠質細胞，而且電鏡下TJ損壞逐漸增加，伴WML加重。進一步支持BBB破壞在腦白質損傷過程中可能起一定作用。我們認為，BBB破壞，可使血漿中的蛋白等成份滲出至腦組織中，可以產生神經纖維毒性作用，從而引起WML的發(fā)病。

總之，我們的研究顯示RHRSP模型是研究高血壓性WML的適用模型；長期高血壓可以破壞BBB的TJ，從而引起血漿白蛋白的漏出，造成神經毒性，引起WML。說明BBB如何破壞，如何引起WML的具體機制仍需進一步探討。

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