荊婧 王雪晶 馬耀華 祝應(yīng)俊 丁曉嵐 滕軍放

帕金森?。≒arkinson’s disease,PD）是一種常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病，致殘率高，嚴(yán)重的威脅中老年人的健康。PD主要的神經(jīng)病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性壞死，以及殘存神經(jīng)元胞漿中嗜酸性包涵體—路易小體（Lewy body,LB）的形成。

α-突觸核蛋白（α-synuclein）是LB的纖維組成成分，PD的發(fā)生、發(fā)展、以及受累腦區(qū)的變性均與α-synuclein的異常聚集有密切的聯(lián)系[1]。常染色體顯性遺傳家族性PD與α-synuclein基因錯(cuò)義突變型A53T相關(guān)，α-synuclein（A53T）通過(guò)破壞多巴胺存儲(chǔ)與釋放、調(diào)控囊泡再循環(huán)、增加氧化應(yīng)激水平導(dǎo)致神經(jīng)變性的發(fā)生[2]。自噬和凋亡雖然在形態(tài)學(xué)方面有明顯區(qū)別，但在功能上又存在聯(lián)系，自噬可保護(hù)細(xì)胞免受凋亡和壞死，也可向凋亡轉(zhuǎn)化共同促進(jìn)細(xì)胞死亡[3]。本研究著眼于α-synuclein（A53T）突變蛋白對(duì)神經(jīng)元自噬水平的調(diào)控，進(jìn)一步探討α-synuclein（A53T）突變蛋白的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院唐北沙教授饋贈(zèng)）常規(guī)培養(yǎng)于10%FBS（GIBCO）的DMEM（GIBCO）完全培養(yǎng)液中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以4×105/mL接種于六孔板里，次日轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染具體操作參考脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000（Invitrogen）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2 Western blot檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EGFP-N1、EGFP-α-synuclein（WT）、EGFP-α-synuclein（A53T）（質(zhì)粒為蘇州大學(xué)王光輝教授饋贈(zèng)）48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，各組樣品采取總蛋白25μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗 3次，加入抗 Beclin 1（Abcam,1:800）、抗 LC3（Eptimics,1：300）抗體，4℃過(guò)夜。次日加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（Promega,1:5000），ECL光化學(xué)法顯色，暗室中行X線(xiàn)膠片曝光。

1.3 MDC檢測(cè) 單丹磺酰尸胺（monodan-sylcadaverine,MDC,Sigma）是一種自噬空泡的標(biāo)志物，可以通過(guò)MDC染色觀察判斷細(xì)胞自噬過(guò)程的發(fā)生。SH-SY5Y細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EGFP-N1、EGFP-α-synuclein （WT） 及 EGFP-α-synuclein（A53T）24 h后，以4%多聚甲醛，4℃下固定10 min，PBS洗3遍，加入終濃度為50 μmol/L的MDC染色液，在熒光倒置顯微鏡（Olympus IX70）下觀察熒光，并在400倍視野下，各組細(xì)胞隨機(jī)抽取10個(gè)不相重復(fù)的視野觀察拍照。

1.4 細(xì)胞免疫熒光化學(xué) 將穩(wěn)定表達(dá)蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染4%多聚甲醛固定10 min，用熒光顯微鏡（Olympus IX70）觀察并分析，并在400倍視野下，各組細(xì)胞隨機(jī)抽取10個(gè)不相重復(fù)的視野觀察拍照。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，兩組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EGFPN1、EGFP-α-synuclein（WT）、EGFP-α-synuclein（A53T）。其中一組24 h后用0.14 g/L EDTA消化，另一組轉(zhuǎn)染后12 h給予10 mmol/L自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA，Sigma）處理，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×105/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液加入 5 μL Annexin-/FITC 和20 μg/mL PI溶液10 μL，孵 育 15 min，流 式 細(xì) 胞 儀 PI/Annexin-V-FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況（Ex=488nm，Em=530nm）。

1.6 細(xì)胞活力測(cè)定 調(diào)節(jié)SH-SY5Y細(xì)胞密度約5×104/mL，以100 μL/孔接種至96孔板內(nèi)，隨機(jī)分成兩組，24 h后兩組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EGFP-N1、EGFP-α-synuclein（WT）、EGFP-α-synuclein（A53T）其中一組12 h后給予10 mmol/L3-MA處理，24 h后每孔加5 mg/mL噻唑藍(lán)（MTT，Sigma）溶液（PBS配制，PH=7.4）20 μL，繼續(xù)孵育4 h。棄上清培養(yǎng)基，每孔加100 μL二甲基亞砜（DMSO），選擇570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性Beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá) SH-SY5Y細(xì)胞過(guò)表達(dá)EGFP-N1、EGFP-α-synuclein （WT） 及 EGFP-αsynuclein（A53T），Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染EGFP-N1組相比，過(guò)表達(dá)α-synuclein（WT）或αsynuclein（A53T）使SH-SY5Y細(xì)胞中Beclin 1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與EGFP-α-synuclein（WT）相比，過(guò)表達(dá) EGFP-α-synuclein（A53T）后 Beclin1蛋白明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如圖1所示。

圖1 Western blot檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)源性Beclin 1蛋白及LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白的表達(dá)

表1 Western blot測(cè)定各組細(xì)胞Beclin 1蛋白表達(dá)平均灰度值及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（）

表1 Western blot測(cè)定各組細(xì)胞Beclin 1蛋白表達(dá)平均灰度值及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（）

1)與EGFP-N1組比較，P＜0.05；2)與EGFP-α-synuclein（WT）組比較P＜0.05

分組EGFP-N1 EGFP-α-synuclein（WT）EGFP-α-synuclein（A53T）Beclin 10.746341±0.161.027893±0.261)1.328772±0.172)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ0.353179±0.080.628300±0.061)0.881202±0.082)

2.2 MDC染色檢測(cè)自噬空泡的變化 在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá) EGFP-N1、EGFP-α-synuclein（WT）及EGFP-α-synuclein（A53T），MDC染色及統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，自噬空泡積聚平均灰度值分別為(1.01±0.23)、(1.12±0.12)、(1.57±0.28)。與轉(zhuǎn)染EGFP-N1組相比，過(guò)表 達(dá)α-synuclein（WT）及α-synuclein（A53T）致MDC染色信號(hào)增強(qiáng)，自噬空泡聚集增多，平均灰度值增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；表明 EGFP-α-synuclein（WT）、EGFP-αsynuclein（A53T）上調(diào)了細(xì)胞自噬水平；與轉(zhuǎn)染EGFP-α-synuclein（WT）相比，過(guò)表達(dá) EGFP-αsynuclein（A53T）導(dǎo)致MDC染色信號(hào)增強(qiáng)，自噬空泡聚集增多，平均灰度值增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如圖2所示。

2.3 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞外源性LC3蛋白的表達(dá) 在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)將EGFP-N1、EGFP-α-synuclein（WT）及EGFP-αsynuclein（A53T）與RFP-LC3共同轉(zhuǎn)染。免疫熒光結(jié)果顯示，α-synuclein與LC3存在亞細(xì)胞共定位；與EGFP-N1組相比，轉(zhuǎn)染EGFP-α-synuclein（WT）或EGFP-α-synuclein（A53T）細(xì)胞胞漿內(nèi)LC3蛋白表達(dá)上調(diào)；與EGFP-α-synuclein(WT)相比，過(guò)表達(dá) EGFP-α-synuclein（A53T）細(xì)胞胞漿內(nèi)LC3蛋白的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。如圖3所示。

熒光結(jié)果顯示，EGFP-α-synuclein（WT）、EGFP-α-synuclein（A53T）與mito存在共定位；與EGFP-α-synuclein（WT）相比 ，過(guò)表達(dá)EGFP-αsynuclein（A53T）可導(dǎo)致mito表達(dá)下調(diào)，表明過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）可致線(xiàn)粒體損傷。如圖4所示。

2.4 PI/Annexin-V-FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡 與轉(zhuǎn)染EGFP-α-synuclein（WT）相比，過(guò)表達(dá)EGFP-αsynuclein（A53T）使細(xì)胞凋亡率上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在體系中加入自噬抑制劑3-MA之后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）較加入3-MA之前細(xì)胞凋亡率均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如表2所示。

圖2 MDC染色檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中自噬空泡的變化（400×）A1、B1、C1為過(guò)表達(dá) EGFP-N1組 ，A2、B2、C2為過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（WT）組，A3、B3、C3為過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）組。箭頭所示為自噬空泡。

圖3 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞外源性LC3蛋白表達(dá)（400×）A1、B1、C1、D1為過(guò)表達(dá)EGFP-N1組 ，A2、B2、C2、D2為 過(guò) 表 達(dá)EGFP-α-synuclein（WT）組 ，A3、B3、C3、D3為過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）組。箭頭所示為RFP-LC3蛋白

圖4 免疫熒光檢測(cè)線(xiàn)粒體形態(tài)改變（400×）A1、B1、C1、D1為 過(guò) 表 達(dá) EGFP-N1組 ，A2、B2、C2、D2為過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（WT）組 ，A3、B3、C3、D3為過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）組。

表2 PI/Annexin-V-FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化（）

表2 PI/Annexin-V-FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化（）

1)與 EGFP-N1比較，P>0.05；2)與 EGFP-α-synuclein（WT）比較，P<0.01；3)與 EGFP-N1+3-MA 比 較 ，P>0.05；4)與 EGFP-α-synuclein（WT）+3-MA比較，P<0.05；5)與 EGFP-N1比較 ，P<0.05；6)與EGFP-α-synuclein（WT）比較，P<0.05；7)與 EGFP-α-synuclein（A53T）比較，P<0.05

組別EGFP-N1 EGFP-α-synuclein（WT）EGFP-α-synuclein（A53T）EGFP-N1+3-MA EGFP-α-synuclein（WT）+3-MA EGFP-α-synuclein（A53T）+3-MA細(xì)胞凋亡率3.92±0.895.63±0.691)19.98±5.982)2.11±0.475)3.11±0.193)6)14.26±3.984)7)

2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 過(guò)表達(dá)EGFP-N1、EGFP-α-synuclein（WT）及 EGFP-α-synuclein（A53T），MTT檢測(cè)細(xì)胞活力分別為（91.23±7.25）、（87.23±8.25）、（58.93±4.01）。而在體系中加入自噬抑制劑3-MA之后，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力分別為（82.01±10.27）、（77.10±7.68）、（72.26±6.03）。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與EGFP-N1相比，EGFP-α-synuclein（WT）組細(xì)胞相對(duì)活力有所減弱，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與EGFP-α-synuclein（WT）相比，過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）可導(dǎo)致細(xì)胞相對(duì)活力減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；加入3-MA后，過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）較加入 3-MA之前細(xì)胞相對(duì)活力增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

α-synuclein是一種伴侶蛋白，可抑制異常蛋白的聚集，促進(jìn)蛋白聚積體的解聚，維護(hù)突觸正常功能，調(diào)節(jié)多巴胺的生物合成[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein可調(diào)節(jié)突觸前神經(jīng)末梢跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，影響多巴胺在神經(jīng)末梢攝取的效率，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活性，并可保護(hù)細(xì)胞免于溫度和氧化應(yīng)激的影響[5]。α-synuclein（A53T）最早是1996年P(guān)olymeropoulos等[6]在對(duì)一個(gè)呈常染色體顯性遺傳的意大利PD家系研究中發(fā)現(xiàn)的。Guo等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)α-synuclein（A53T）的表達(dá)可削弱磷脂膜結(jié)合力，抑制囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2（vesicular monoamine transporter,VMAT2）的活力，干擾多巴胺的代謝。Lotharius等[8]在人胚胎中腦細(xì)胞MESC2.10中轉(zhuǎn)染α-synuclein（A53T）發(fā)現(xiàn)α-synuclein（A53T）可通過(guò)降低囊泡儲(chǔ)存釋放功能，使胞質(zhì)內(nèi)多巴胺異常增多，影響多巴胺內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，并發(fā)現(xiàn)α-synuclein（A53T）可增加合成多巴胺的細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激死亡。

自噬（autophagy）是細(xì)胞內(nèi)的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞器在溶酶體內(nèi)降解的過(guò)程，能夠滿(mǎn)足細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和能量需求，維持能量平衡。自噬廣泛存在于正常的生理過(guò)程中，又是細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的一種防御機(jī)制；研究證實(shí)其在神經(jīng)退行性疾病中可參與異常蛋白質(zhì)的降解，防止神經(jīng)元內(nèi)異常蛋白質(zhì)的蓄積。在巨自噬形成過(guò)程中，LC3蛋白的修飾過(guò)程對(duì)自噬泡形成起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)明顯增多，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯增高[9-10]。Beclin 1是哺乳動(dòng)物自噬的特異性基因[11]，通過(guò)與Vps34結(jié)合激活P13K促進(jìn)自噬體的形成[12]，是自噬通路的必要步驟[13]。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，在PD等神經(jīng)變性疾病患者的腦中，存在自噬體的積聚，即自噬異常調(diào)控參與了PD等神經(jīng)變性疾病的病理過(guò)程[14]。本實(shí)驗(yàn)過(guò)表 達(dá) EGFP-α-synuclein（WT）及 EGFP-α-synuclein（A53T），與EGFP-N1組相比均可上調(diào)Beclin 1蛋白的表達(dá)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高。過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）與 α-synuclein（WT）組相比，Beclin 1蛋白及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值進(jìn)一步上調(diào)。以上結(jié)果證實(shí)α-synuclein（A53T）上調(diào)SHSY5Y細(xì)胞巨自噬水平。α-synuclein通過(guò)自噬轉(zhuǎn)入溶酶體腔內(nèi)降解，而α-synuclein（A53T）與溶酶體膜表面受體Lamp2A親和力異常高，可阻斷溶酶體攝取，從而抑制自噬底物降解，激活巨自噬途徑[15]。

自噬與凋亡是兩種程序性細(xì)胞死亡方式，在參與維持機(jī)體正常的生理平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，然而近年來(lái)研究提示，二者在某些情況下可以相互拮抗或促進(jìn)。以往研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系CCRF-CEM發(fā)生自噬和凋亡，且自噬早于核黃素片出現(xiàn)，3-MA可完全抑制DNA片段化和胞漿降解，而天冬酰胺（溶酶體和自噬體融合抑制劑）不能阻斷TNF-α誘導(dǎo)的凋亡[16]，證明在某些條件下，自噬先于凋亡出現(xiàn)，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡。本研究過(guò)表達(dá)EGFP-α-synuclein（A53T）較 EGFP-α-synuclein（WT）組細(xì)胞凋亡率明顯增高，細(xì)胞活力減弱。而加入自噬抑制劑后，細(xì)胞凋亡率有所減少，細(xì)胞活力有所增強(qiáng)?？紤]可能的機(jī)制為：作為自噬的標(biāo)記蛋白Beclin 1可以提高caspase-9的活性[17]，進(jìn)一步激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等效應(yīng)caspase，進(jìn)而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

本研究著眼于α-synuclein（A53T）對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬及凋亡的調(diào)控，并發(fā)現(xiàn)α-synuclein（A53T）通過(guò)上調(diào)SH-SY5Y中Beclin 1蛋白及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，上調(diào)自噬水平，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此我們認(rèn)為，調(diào)控自噬可能成為PD一個(gè)新的治療方向。

[1]Spillantini MG,Schmidt ML,Lee VM,et al.Alpha-synuclein in Lewy bodies[J].Nature,1997,388(6645):839-840.

[2]張克忠.α-synuclein與帕金森病[J].中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2004 ，12(4)：434-437.

[3]鄭海燕，王興芬，孫保存.自噬與凋亡相互關(guān)系的分子機(jī)制探討[J].醫(yī)學(xué)綜述，2011,17(1):22-24.

[4]錢(qián)進(jìn)軍，程言博，劉春風(fēng)，等.人SNCA及其致病突變基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒pEGZ/MCSHA載體的構(gòu)建[J].中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué) 2006，14(6):561-565.

[5]熊中奎，胡雅兒.α-突觸核蛋白的生物學(xué)功能及其在帕金森病中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2010,26（9）：1855-1858.

[6]Polymeropoulos MH,Lavedan C,Leroy E,et al.Mutation in the α-syn gene identified in families with Parkinson’s disease[J].Science,1997,276(5321):2045-2047.

[7]Guo JT,Chen AQ,Kong Q,et al.Inhibition of vesicular mono?amine transporter-2 activity in alpha-synuclein stably transfect?ed SH-SY5Y cells[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28(1):35-47.

[8]Lotharius J,Barg S,Wiekop P,et al.Effect of mutant al?pha-synuclein of dopamine homeostasis in a new human mesen?cephalic cell line[J].J Biol Chem,2002,277(41):38884-38894.

[9]伍靜，趙勇，師長(zhǎng)宏，等.自噬的形態(tài)特征及分子調(diào)控[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10(20)：3941-3944.

[10]王海杰，譚玉珍.細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)特征和功能意義[J].解剖學(xué)報(bào)，2009，40(5)：844-849.

[11]Luo S,Rubinsztein DC.Apoptosis blocks Beclin 1-dependent autophagosome synthesis:an effect rescued by Bcl-xl[J].Cell Death Differ,2010,17(2):268-277.

[12]Meijer AJ,Codogno P.Regulation and role of autophagy in mammalian cells[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36(12):2445-2462.

[13]Shintani T,Klionsky DJ.Autophagy in health and disease:a double-edged sword[J].Science,2004，306(5698):990-995.

[14]Rubinsztein DC,Gestwicki JE,Murphy LO,et a1.Potential ther?apeutic applications of autophagy[J].Nat Rev Drug Diseov,2007,6（4）:304-312.

[15]Lindersson E,Lundvig D,Petersen C,et al.p25alpha Stimu?lates alpha-synuclein aggregation and is co-localized with ag?gregation and is co-localized with aggregated alpha-synuclein in alpha-synucleinopathies[J].J Biol Chem,2005,280(7):5703-5715.

[16]Besson A,Dowdy SF,Roberts JM.CDK inhibitors:cell cycle regulators and beyond[J].Dev Cell,2008,14(2):159-169.

[17]Furuya D,Tsuji N,Yagihashi A,et a1.Beclinl augmented cis-diamminedichlo-roplatinum induced apoptosis via erdaancing caspase-9 activity[J].Exp Cell Res,2005,307(1):26-40.