鄒美圣 劉凌 劉澤 王魯妮 吳軍 王偉 封菊香

人類進(jìn)入老年期后，隨增齡與衰老相關(guān)的各種疾病如動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生率也隨之上升，而內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)改變是人類衰老和疾病的基礎(chǔ)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在其中起著重要的作用[1]。AngⅡ是RAS系統(tǒng)中最具活性的成分，具有促炎癥活性和氧化活性，參與慢性炎癥過程。AngⅡ由AT1介導(dǎo)可通過多種機(jī)制產(chǎn)生對內(nèi)皮細(xì)胞的致炎作用[2]。炎性衰老的概念由Franceschi等[3]在2000年首次提出，炎性衰老中的促炎性反應(yīng)與老年相關(guān)疾病如AS等密切相關(guān)[4]。目前炎性衰老的機(jī)制主要有應(yīng)激論和細(xì)胞因子論[5]，細(xì)胞因子論認(rèn)為促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6等)在炎性衰老發(fā)生發(fā)展中起著核心作用[6]。本研究旨在觀察AngⅡ是否可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HUVECs衰老，以及其中IL-6、TNF-α分泌的變化，并探討炎癥因子在炎性衰老致AS中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVECs由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、AngⅡ、CCK-8購自美國Sigma公司;細(xì)胞周期流式細(xì)胞分析試劑盒、細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑公司;人IL-6、人TNF-αELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本);酶標(biāo)儀(Tecan Genios，瑞士);流式細(xì)胞儀(Miltenyi公司，德國)。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 HUVECs細(xì)胞株貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次維持細(xì)胞良好生長狀態(tài)。待細(xì)胞長至融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。HUVECs呈多角形，單層鋪路石樣緊密排列。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 將細(xì)胞以5000個/孔接種于96孔板中，每孔加100μl培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱過夜，棄去培養(yǎng)液后，對照組(5孔)每孔加入100μl培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組(每組5孔)加入含不同濃度(10－8、10－7、10－6和10－5mol/L)Ang Ⅱ100 μl培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前向每孔加入CCK-8 20μl培養(yǎng)1 h，酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm下測定各孔OD值，以藥物組與對照組OD值百分比代表細(xì)胞增殖率。每組設(shè)5復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.4 衰老細(xì)胞鑒定 細(xì)胞長至亞融合后，無血清同步12h，加入終濃度為10－6mol/L AngⅡ，持續(xù)刺激48 h，第12 h、24 h各補(bǔ)充AngⅡ 1次即為AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs衰老模型。對照組為不含AngⅡ上述培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.4.1 β-半乳糖苷酶染色:根據(jù)細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒操作方法，將原培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液棄去，PBS清洗細(xì)胞1次，每孔加入SA-β-gal染色固定液1 ml，室溫固定15 min。吸除固定液后PBS洗3次，每次3 min。每孔加入染色工作液1 ml，37℃無CO2條件下孵育過夜。用保鮮膜將六孔板封住以防止蒸發(fā)。熒光顯微鏡下每組標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，胞漿藍(lán)染者為陽性細(xì)胞即衰老細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.4.2 細(xì)胞周期分析:收獲的細(xì)胞冷乙醇4℃固定過夜。取5×106細(xì)胞，1000 r/min離心棄乙醇，PBS洗2遍;加入碘化丙啶(PI)染液，4℃避光孵育30 min。過篩后立刻上機(jī)檢測進(jìn)行細(xì)胞流式周期分析。

1.5 雙抗體夾心ELISA檢測上清中IL-6、TNF-α濃度按照上述方法誘導(dǎo)細(xì)胞衰老后，取細(xì)胞培養(yǎng)液上清離心，再收集上清置于－20℃保存，然后按人IL-6、人TNF-αELISA試劑盒說明書操作，置于酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，每組設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)2次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋)表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率CCK-8法檢測表明，經(jīng)不同濃度AngⅡ培養(yǎng) HUVECs 48 h 后，10－8和 10－7mmol/L Ang Ⅱ組細(xì)胞存活率與對照無明顯差異(P＞0.05);10－6和10－5mmol/L AngⅡ組存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。10－5mmol/L AngⅡ在48 h即引起細(xì)胞生長停滯，增殖率降低，從而可能因濃度過高而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，不能誘發(fā)細(xì)胞衰老;10－8和10－7mmol/L AngⅡ在48 h內(nèi)仍未引起明顯的細(xì)胞生長停滯，從而可能因濃度過低不至于引起細(xì)胞衰老;10－6mol/L AngⅡ組細(xì)胞存活率為(77.15±1.85)%，故本實(shí)驗(yàn)選用10－6mol/L AngⅡ建立HUVECs衰老模型。

2.2 衰老細(xì)胞鑒定

2.2.1 SA-β-gal活性:SA-β-gal化學(xué)染色陽性細(xì)胞的胞漿和胞核呈藍(lán)染。染色后對照組幾乎不表達(dá)β-gal，AngⅡ誘導(dǎo)組β-gal陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，約80%細(xì)胞染色陽性(圖1)。

圖1 AngⅡ?qū)UVECs SA-β-gal活性的影響

2.2.2 細(xì)胞周期分析:細(xì)胞增殖能力下降是衰老的另一個生物學(xué)標(biāo)志，而細(xì)胞周期可以反映細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，對照組HUVECs的各期比例正常，AngⅡ誘導(dǎo)大部分細(xì)胞停滯于G0/G1期，S期及G2/M期趨于消失，與對照組比較，各周期的細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。表明誘導(dǎo)組細(xì)胞生長逐漸停滯，細(xì)胞增殖能力明顯下降。

表1 AngⅡ?qū)?xì)胞周期的影響(，%)

表1 AngⅡ?qū)?xì)胞周期的影響(，%)

注:與對照組比較，＊＊P＜0.01

組別 樣本數(shù)(個) G0/G1期 S期 G2/M期對照組5 49.5±5.5 31.0±5.3 19.4±1.7 AngⅡ誘導(dǎo)組 5 89.4±3.4＊＊8.0±3.1＊＊2.0±1.5＊＊

2.3 AngⅡ?qū)UVECs培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α分泌的影響 正常對照組有一定基礎(chǔ)量的IL-6、TNF-α分泌，經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后 IL-6、TNF-α分泌顯著增加(P＜0.01)，但I(xiàn)L-6較對照組上升超過2倍，而TNF-α僅為1倍左右。

表2 AngⅡ?qū)ρ装Y因子的影響(，%)

表2 AngⅡ?qū)ρ装Y因子的影響(，%)

注:與對照組比較，＊＊P＜0.01

組別 樣本數(shù)(個) IL-6 TNF-α對照組575±31 32±19 AngⅡ誘導(dǎo)組 5 178±28＊＊ 58±23＊＊

3 討論

在過去的幾十年，我們對AS發(fā)病機(jī)制的理解經(jīng)歷了一場革命[7]，由先前被認(rèn)為主要是管道問題、退行性疾病，轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N多因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)性疾病[8-9]。衰老是AS的獨(dú)立危險因素，AS的發(fā)生率隨增齡急劇上升[10]。而炎性衰老是衰老研究領(lǐng)域的一個新成員，目前血管緊張素系統(tǒng)在血管衰老機(jī)制研究中逐漸被重視，AngⅡ信號級聯(lián)反應(yīng)隨衰老增加，最終促進(jìn)AS的發(fā)展，抑制AngⅡ的活性已被證明能降低心血管疾病的發(fā)病率和病死[11]。最近研究表明，AngⅡ可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)激活導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老[12]。故本文用 AngⅡ誘導(dǎo) HUVECs為衰老模型[13]，研究體外細(xì)胞復(fù)制衰老過程中IL-6、TNF-α 分泌的變化。

AngⅡ是誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的一種常用物質(zhì)，我們以目前公認(rèn)的衰老標(biāo)志物:SA-β-gal和細(xì)胞的增殖能力為主要觀察指標(biāo)，對AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs衰老的可能性進(jìn)行觀察。阮云軍等[14]用過氧化氫誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞衰老，觀察到G1期細(xì)胞比例和SA-β-gal染色陽性細(xì)胞百分比增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs 48 h后出現(xiàn)了衰老的表型，SA-β-gal活性和停滯在G0/G1期的比例明顯升高，說明AngⅡ已成功誘導(dǎo) HUVECs衰老模型，可用于細(xì)胞衰老機(jī)制的研究。

炎癥貫穿于AS發(fā)生和發(fā)展的全過程，大量炎癥因子對AS的形成和發(fā)展發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[15]。IL-6影響多種細(xì)胞的生長、分化或基因表達(dá)，活化的內(nèi)皮細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的IL-6，IL-6也刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增生，增加內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力[16];IL-6可以直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[17];還可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞及血液中淋巴細(xì)胞黏附能力[18]。TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，其在AS和炎癥中發(fā)揮作用。循環(huán)中的TNF-α的水平同年齡相關(guān)AS的危險成正相關(guān)[14]。TNF-α可以抑制一氧化氮合酶的生成，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[19];并且還可以刺激炎癥因子生成，直接發(fā)揮促炎作用[20]，從而加速AS的形成和發(fā)展。周建軍等[21]研究表明TNF-α可能通過影響線粒體功能而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老。老年人血清中IL-6和TNF-α水平的升高與疾病、殘疾和死亡率有關(guān)。對大量人群的研究表明血清IL-6水平可作為老年人功能殘疾的可靠標(biāo)志，也可作為老年人炎性衰老的預(yù)測指標(biāo)[22]。從對健康老年人研究發(fā)現(xiàn)，衰老與高炎癥反應(yīng)狀態(tài)相關(guān)。高炎癥反應(yīng)狀態(tài)的原因是循環(huán)中促炎癥細(xì)胞因子介質(zhì)，包括IL-1、IL-6、TNF-α和前列腺素2(PGE2)水平的升高[23-24]。本研究表明，AngⅡ誘導(dǎo)組比正常對照組IL-6、TNF-α分泌明顯增加(P＜0.01)，但I(xiàn)L-6較對照組上升＞2倍，而TNF-α僅為1倍左右，與文獻(xiàn)報道一致。

炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)貫通于炎癥和衰老網(wǎng)絡(luò)，探討炎性衰老的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控新機(jī)制，是研究炎性衰老的新策略[25]。有研究表明，促炎細(xì)胞因子能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。DNA損傷激活核因子-κB(NF-κB)等信號通路產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-8等)，從而阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)和維持細(xì)胞衰老表型[26]。促炎細(xì)胞因子(如 TNF-α、IFN-β、IFN-γ 等)通過產(chǎn)生活性氧和激活A(yù)TM/p53/p21(WAF1/Cip1)信號通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞衰老[27]。綜上所述，AngⅡ可以誘導(dǎo) HUVECs衰老，其機(jī)制可能與IL-6、TNF-α分泌增加有關(guān)，但其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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