單玉興，張海玉，王立君，萬法青，盧良杰

（吉林大學白求恩醫(yī)學部第一醫(yī)院1.骨科；2.兒外科，吉林 長春130021）

藤黃酸（gambogic acid，GA）為新型抗腫瘤藥物，對正常組織細胞無副作用，是很有發(fā)展前景的抗腫瘤藥物［1］。端粒酶在腫瘤細胞的發(fā)生，發(fā)展中所起的作用已被認可。90%以上的腫瘤細胞都具有較高的端粒酶活性，而多數的體細胞則缺少端粒酶活性［2］。端粒酶以自身的R N A為模板逆轉錄合成端粒D N A重復序列并添加到端粒末端，以補償因細胞每次分裂而丟失的末端堿基，保證染色體結構的穩(wěn)定性和完整性，為腫瘤細胞的永生化提供了條件。端粒酶逆轉錄酶（hTERT）是端粒酶的限速成分，hTERT基因的表達調控對端粒酶表達活性調節(jié)起決定性作用，Bcl－2基因（即B細胞淋巴瘤／白血?。?基因）是一種原癌基因，具有抑制細胞凋亡的作用。hTERT和Bcl－2蛋白都是很好的腫瘤治療靶點，本實驗通過研究GA對骨肉瘤細胞中hTERT和Bcl－2蛋白的影響，為GA治療骨肉瘤的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞株（HOS和CCK8）購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。GA購于北京易萊西諾生物科技有限公司。主要試劑：胎牛血清（HyClone）購于賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司。hTERT抗體購于Santa Cruz公司；Bcl－2抗體，DAB顯色試劑盒，免疫組化染色試劑盒（SP試劑盒）均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和100μ／ml雙抗的高糖DMEM（含酚紅）。

1.2.2 CCK－8法檢測細胞增殖狀況 將細胞種植于96孔板中，每孔5×103個細胞。培養(yǎng)24h后，每孔分別加入終濃度為0.125，0.25，0.5，1，2，4，8 μmol／L，含有 GA的培養(yǎng)基200μl，同時設一不加藥物組，置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h，72h，96 h，120h后每孔加入CCK－8溶液20μl，培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4h。選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光值；在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并照相。以時間為橫軸，吸光值為縱軸繪制細胞生長曲線。細胞存活分數（survival fraction，SF）計算公式為：SF（%）＝（實驗組 OD值／對照組 OD值）×100%。實驗進行3次，最后以3個平行樣品的SF均值±標準差（±s）繪制時間－存活曲線。

1.2.3 免疫組化檢測hTERT和Bcl－2蛋白的表達

將細胞種植于24孔板中，每孔4×105個細胞，設置2個實驗組，每組3個平行樣，同時設立對照組。培養(yǎng)24h后，每孔加入含有最適濃度GA培養(yǎng)基1 ml，培養(yǎng)3d，5d。采用鏈霉素親生物素－過氧化酶聯接法（SP法）。常規(guī)固定，染色，10倍倒置顯微鏡下，選取具有適當形態(tài)學特征的細胞照相。應用Image J軟件和Image Pro Plus軟件對免疫組化圖像進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學處理：采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學處理。數據以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，相關分析采用配對卡方檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 GA作用后細胞存活 細胞存活曲線描述了不同藥物劑量在不同時間骨肉瘤細胞存活情況。見圖1。

骨肉瘤HOS細胞的存活率隨著時間的推移明顯降低，而且未見明顯的后期細胞增殖。相關性分析結果顯示，細胞的存活率與藥物劑量呈負相關（P＜0.01）。

2.2 hTERT和Bcl－2蛋白檢測 應用Image Pro Plus軟件對免疫組化圖像分析表明各圖像灰度值逐漸增強，說明各圖像蛋白含量逐漸減低。數據顯示實驗組的hTERT和Bcl－2蛋白表達明顯低于對照組，且表達強度明顯與時間呈負相關。（見表1）。

圖1 凋亡率與時間、藥物劑量之間的關系

表1 免疫組化圖像灰度值分析

應用Image J軟件對免疫組化圖像進行陽性細胞計數，陽性細胞越多，說明表達hTERT和Bcl－2蛋白的細胞越多，也就意味著表達hTERT和Bcl－2蛋白的細胞分布之廣，反之亦然。經配對卡方檢驗，差異有顯著性（P＜0.05）.（見表2）

表2 免疫組化圖像陽性細胞數分析

2.3 hTERT和Bcl－2蛋白表達的關系 通過配對卡方檢驗，發(fā)現hTERT和Bcl－2蛋白的表達具有高度的一致性，兩者表達具有顯著相關性（P＜0.05）。

3 討論

本實驗在了解hTERT與Bcl－2蛋白的諸多行為關系的基礎上，旨在了GA對骨肉瘤（HOS）中hTERT和Bcl－2蛋白的影響及可能相關性，同時為GA的臨床應用提供理論依據。

骨肉瘤（成骨肉瘤）是最常見的惡性骨腫瘤。發(fā)病率很高，典型骨肉瘤一般見于10－20歲年齡段，但在任何年齡段都可發(fā)生，包括嬰幼兒，兒童以及老年人。男性發(fā)病率較高，男女之比約2∶1。具有很強的局部浸潤能力和肺轉移能力。手術治療已大大提高了患者的預后，但有很高的致殘率。

常規(guī)化療副作用大，且預后較差。GA為抗腫瘤一類新藥，已進入臨床研究。目前研究表明GA在有效劑量范圍內毒副作用比較小，其抗癌作用與一般的化療抗癌藥有所區(qū)別，能選擇性的殺死癌細胞，而對正常組織細胞無明顯影響，有很好的發(fā)展前景。

端粒酶在90%的癌細胞中高表達，而在正常細胞中表達很少，是公認的抗癌靶點，可反映化療的效果［3］。而端粒酶活性受hTERT 的調控［4，5］，是端粒酶的限速酶［6］，與端粒酶活性具有平行關系［7，8］。目前很多學者將目光轉向hTERT，希望能夠有所突破［9］。Bcl－2基因是大家關注熱點，已有大量文獻報道Bcl－2蛋白可保護細胞免于凋亡，同時提高hTERT 的表達［10－12］，但是也有實驗證實 Bcl－2蛋白與hTERT 無相關，甚至負相關［13，14］。

本實驗發(fā)現未經處理的骨肉瘤細胞在光鏡下觀察主要為短梭形，細胞排列緊密，核大，核分裂多見，細胞密集時呈多層生長。經GA處理后，細胞形態(tài)變成以多角形為主，單層排列，細胞大小趨向均一，核小而深染，提示形態(tài)上出現分化改變。隨著藥物濃度的增高，骨肉瘤細胞的凋亡率明顯增大；隨著藥物作用時間的延長，細胞的凋亡率也明顯增大。在最適濃度的作用下，以時間為軸線，在對照組中，hTERT和Bcl－2蛋白的表達無明顯變化；在實驗組（3d），實驗組（5d）中，hTERT和Bcl－2蛋白的表達在逐漸減弱，與藥物作用時間呈負相關，與相關報道一致［15，16］；二者與藥物存在時間依賴關系，在表達上呈高度一致性。

GA、hTERT存在時間依賴關系，但是并不確定GA是否直接影響端粒酶活性；Bcl－2蛋白與hTERT存在高度一致性，二者之間是否存在互相協(xié)助的作用，有待進一步研究；因部分正常組織中存在端粒酶活性，所以GA對其有無副作用，同樣有待進一步研究；hTERT和Bcl－2基因蛋白的表達的測定是半定量的，還存在某些假陽性和假陰性的可能；腫瘤細胞內為低PH狀態(tài)［17］，但本實驗的腫瘤細胞是在pH7.2－7.4狀態(tài)下進行的，這不能反映體內惡性腫瘤組織的低PH狀態(tài)。以上問題有待進一步論證。

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