羅招云，陳 強，楊立業(yè)，林 敏，陳默蕊

（1.南方醫(yī)科大學附屬潮州中心醫(yī)院 檢驗實驗中心，廣東 潮州521000；2.吉林大學公共衛(wèi)生學院）

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，僅次于乳腺癌占惡性腫瘤的第二位［1］。研究證實高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR－HPV）持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生的最重要危險因素［2］。目前關(guān)于16及18型HPV的報道很多，對52型的研究較少見。HPV52作為HPV16簇群中的成員，具有高度致癌性的HPV型別，在亞洲等地呈現(xiàn)特殊的流行狀況，逐漸引起人們的關(guān)注。HPV52是潮州地區(qū) HR－HPV優(yōu)勢基因型別（30.55%，1005／3290）［3］。由于 HPV52與不同遺傳背景的宿主相互作用會引起病毒的變異，影響HPV感染和轉(zhuǎn)歸，了解HPV52基因多態(tài)性將為明確宮頸癌的發(fā)生和運用免疫學策略預(yù)防HPV52相關(guān)疾病提供新的思路。由于源于中國內(nèi)地的HPV52基因序列較少，本研究在潮州地區(qū)采集女性宮頸脫落細胞標本，進行HPV分型和HPV52L1測序，將所獲得的HPV52L1序列與GenBank基因庫中的聯(lián)合進行系統(tǒng)全面分析，探討HPV52L1基因多態(tài)性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 取自2009年8月至2010年8月間潮州地區(qū)農(nóng)村女性宮頸癌篩查的49458份宮頸脫落細胞標本（年齡35～60歲，平均46.98歲，均為生育女性，先前均無宮頸手術(shù)史）。先進行HR－HPV 13種高危型別的實時熒光定量PCR篩查（杭州博日），陽性者再進行21型核酸分子快速導流雜交分型檢測（凱普生物技術(shù)有限公司）。HR－HPV陽性者同時進行液基薄層細胞學檢查（LCT）。LCT檢查采用廣州安必平醫(yī)藥公司提供的制片儀器（LBP－2801）及其配套試劑，以 The Bethesda System（TBS）報告系統(tǒng)為診斷標準。選擇單純HPV52型感染陽性的標本為研究對象。

1.2 標本的采集 此次宮頸癌篩查活動通過了潮州市中心醫(yī)院倫理委員會的批準。標本采集前由受檢者簽署知情同意書。由?？漆t(yī)生使用凱普公司專用宮頸刷完成。擴陰器暴露宮頸口后，棉拭子擦去分泌物，宮頸刷順時針刷轉(zhuǎn)3～5圈后將宮頸刷保存于樣品管的保存液中。

1.3 DNA模板的制備 DNA提取試劑盒（凱普公司生物技術(shù)有限公司），標本制備按說明書操作。

1.4 目的序列PCR擴增和測序 HPV52L1PCR以上述提取DNA為模板。HPV52L1引物設(shè)計根據(jù)GenBank基因庫天津參考株（TJ49－52，ACCESSION：GQ472848）序列設(shè)計特異性引物，并經(jīng)Primer5.0分子生物學軟件分析優(yōu)化。參考Gen－Bank基因庫中HPV52L1區(qū)通用型引物 MY09／MY11， MY09：5’－CGTCCMARRGGAWACTGATC－3’， MY11： 5 ’－GCMCAGGGWCATA－AYAATGG－3’；因L1基因序列全長1590bp較長，故將L1分為4個區(qū)段，自行設(shè)計HPV52L1區(qū)段特異引物正反向4對，分別為HPV52－L1－1，

F：5′－CCATTACCTTCGTTACCCACA－3′，

R：5′－AGGATGCCCACTAATACCC－3′HPV52－L1－2，

F：5′－GCTTGGAAATCGGTAGGG－3′，R：5′－GCAGTATTGCCAGAGTTAGACC－3′HPV52－L1－3，

F：5′－AGGGTCTAACTCTGGCAATAC－3′，

R：5′－CCTGTAGCCCTGCCTGTA－3′HPV52－L1－4，

F：5′－ATGAAAATTTTAAGGAATACC －3′，

在2017—2018秋季學期“生物化學”課程的教學中，采用“大班授課、小班研討”、“設(shè)計問題和案例”、“網(wǎng)絡(luò)平臺實現(xiàn)師生互動”、“改變成績評價體系”等方面的教學改革，在提高大班型授課效率方面取得了一定成效，并對上課模式和效果進行了無記名問卷調(diào)查，向參與的學生（參與傳統(tǒng)教學問卷為120人，參與教學改革后問卷為110人）提出了5個問題。

R：5′－ACATACATAACATGCAAACAAC－3′上述引物均由Invitrogen生物技術(shù)有限公司（上海）合成。PCR擴增儀為ABI2700熱循環(huán)儀。L1基因PCR反應(yīng)條件：50μl反應(yīng)體系（包含2μl模板DNA，滅菌去離子水34.0μl，10×PCR Buffer 5.0 μl，dNTPs 4.0μl（0.2mmol／L），DMSO為1μl，引物P1，P2各1.6μl（0.4μmol／L），Taq DNA 聚合酶1U／0.8μl）；L1－1反應(yīng)條件為：93℃5min后進行循環(huán)，93℃1min，52℃1min，72℃1min，36個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果并照相。L1－2、L1－3、L1－4的反應(yīng)條件與 L1－1只有第三步的退火溫度不同，分別為 L1－2（52℃），L1－3（57℃），L1－4（57℃），其它步驟與 L1－1完全一致。HPV52 L1PCR反應(yīng)產(chǎn)物送廣州英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司雙向測序，對測序結(jié)果進行分析。Taq酶、dNTPs、PMD18－T載體為TakaRa公司產(chǎn)品。

1.5 HPV52L1區(qū)段序列測定 因L1序列全長1 590bp較長，故將L1分為4個區(qū)段，分別用L1－1、L1－2、L1－3、L1－4進行 DNA 測序，測序后再拼接。利用BLAST將所測序列與GenBank基因庫中HPV52序列進行比對。

1.6 序列分析 通過BioEdit軟件工具向Gen－Bank核酸數(shù)據(jù)庫提交，利用BLAST和DNA STAR等在線分析工具對所獲得序列進行分析，將所測序列與GenBank基因庫中天津參考株（ACCESSION：GQ472848）的HPV52L1編碼區(qū)序列進行比對。對出現(xiàn)的變異進行多態(tài)性分析。本研究獲得的73株組成數(shù)據(jù)集，合并全同序列，然后分組。將潮州地區(qū)的HPV52L1變異株基因序列上交NCBI GenBank基因庫。

1.7 建立 HPV52－L1進化樹 通過BioEdit、Clustal－1.8和 Mega－5.05軟件工具，以及利用 NCBI→BLAST在線分析工具，按照構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的步驟操作。

2 結(jié)果

2.1 HPV52L1基因的PCR擴增結(jié)果及初步鑒定以選取的101例HPV52單純感染者宮頸脫落細胞 DNA 為模板，成功獲得 L1－1、L1－2、L1－3、L1－4各83份PCR擴增陽性產(chǎn)物，PCR擴增產(chǎn)物長度分別為：L1－1為526bp、L1－2為547bp、L1－3為596 bp、L1－4為560bp。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后，分別在相應(yīng)位置附近顯示一條特異DNA條帶，其大小與預(yù)期值一致，見圖1。

圖1 HPV52－L1中4片段PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

2.2 HPV52－L1序列測定和分析 將83份L1－1、L1－2、L1－3、L1－4PCR擴增陽性產(chǎn)物進行正、反雙向測序，成功獲得正、反各73條 L1－1、L1－2、L1－3、L1－4基因序列，利用BioEdit和DNA STAR等在線分析軟件將 L1－1、L1－2、L1－3、L1－4再拼接成 HPV52 L1全序列。利用DNA STAR／Edit Seq軟件分析，以天津參考株L1編碼區(qū)序列中起始密碼和終止密碼處小片段，找到相對應(yīng)的起始密碼和終止密碼，起始密碼和終止密碼之間的基因序列就是所測的L1編碼區(qū)序列，再利用BLAST在線分析工具，將HPV52L1基因序列與GenBank收錄的天津參考株L1編碼區(qū)序列進行比對，一致性均為99%。對73條HPV52L1核苷酸序列進行同源性分析，L1基因型內(nèi)核苷酸同源性為99.1%～99.9%，符合分型規(guī)律［4］。

表1 HPV52－L1基因測序結(jié)果與潮州地方株比對堿基突變類型和位置

2.4 HPV52L1 15組序列進化樹之間的關(guān)系 進化樹中上部分的潮州地區(qū)的12組編碼序列與廣州的、天津的、浙江等國內(nèi)的和泰國、印度等東南亞國報道株親緣關(guān)系最近；進化樹中下部分的CZ52D416組編碼序列與 TJ49－52（GQ472848）株和 Qv03594（HQ537740）株親緣關(guān)系最近；進化樹下部分的2組（CZ52E928、CZ52E136）編碼序列與哥斯達黎加和德國等美歐國家報道的株親緣關(guān)系最近，見圖2。

圖2 HPV52－L1 15組序列進化樹

2.5 HPV52不同突變株的Accession號和73株感染者的LCT結(jié)果 將潮州地區(qū)15株不同的HPV52 L1變異株基因序列上交GenBank基因庫，獲得15株 的 Accession 號，GenBank accession codes：JN874416、JN874417、JN874419 ～ JN874428、JN874430、JN874434、JN874436。為了了解 HPV52 L1變異株的致瘤性，比較不同的HPV52L1變異株群的宮頸病變嚴重程度差別，其中CZ52A105組中有1例高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high grade squamous intraepithelial lesions，HSIL），CZ52A277組為1例鱗狀細胞癌（squamous cell cancer，SCC）見表2。

3 討論

研究表明HPV52在中國和亞洲婦女中常見［5］。某些地區(qū)甚至高于 HPV16和 HPV18，在上海、四川、廣東等地，高發(fā)態(tài)勢尤為明顯［6］。HPV52作為HPV16簇群中的成員，是具有高度致癌性的HPV型別之一［7］，在亞洲等地呈現(xiàn)特殊的流行狀況。L1基因是HPV晚期結(jié)構(gòu)蛋白基因，有較強的抗原性和免疫原性，能誘導機體B細胞產(chǎn)生中和抗體，從而阻斷病毒感染，因而L1蛋白是防治HPV感染基因工程疫苗研究的重要靶抗原［8］。研究證實，不同地域間HPV L1基因存在變異現(xiàn)象［9］。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)揚州地區(qū)L1基因存在7處變異［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，潮州地區(qū)HPV52L1基因序列有31處堿基分別出現(xiàn)變異，其中6處由于核苷酸的改變，其編碼氨基酸也相應(yīng)發(fā)生變化；另外25處為同義突變，未影響氨基酸的改變。提示HPV52L1編碼基因中可能存在一系列中國地區(qū)的高頻率突變位點；結(jié)果也提示潮州地區(qū)不同L1基因序列之間存在差異，特別是氨基酸的改變，可能會造成HPV52L1蛋白免疫原性的差異。有學者報道HPV不同的變異株與子宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）程度相關(guān)［11］。HPV16的亞美或非洲變異株比歐洲變異株具有更強的發(fā)生宮頸癌的危險性［12］。本研究分析了潮州地區(qū)HPV52L1基因的突變譜及主流型，并預(yù)測了其功能變化。L1蛋白的改變將導致病毒的組裝、感染以及抗原表位的改變，使病毒逃避機體免疫識別，從而造成病毒的持續(xù)和重復感染，促進宮頸癌的發(fā)生［13］。提示L1基因突變?yōu)镠PV52型種系發(fā)生提供了確鑿的資料，也為HPV52型預(yù)防性疫苗研制提供新的思路和基本條件。潮州地區(qū)的L1基因多態(tài)性形成15種突變模式，分為東亞和歐洲2種譜系。主流突變的東亞群L1基因序列多與國內(nèi)的（廣州、天津、浙江等）和東南亞地區(qū)（泰國、印度、香港、臺灣等）報道的HPV52株同源；歐美群L1基因序列與哥斯達黎加和德國等歐美國家報道的株親緣關(guān)系最近。說明不僅在不同國家之間，即便在我國不同地區(qū)之間和不同檢測對象之間，L1基因多態(tài)性也存在較大的差異。

表2 HPV52不同突變株的Accession號和LCT結(jié)果（n＝73）

綜上所述，HPV52在亞洲CIN發(fā)生中可能占據(jù)重要地位。本研究探明了潮州地區(qū)HPV52L1基因結(jié)構(gòu)特點和變異規(guī)律，為制備適合中國人群的HPV宮頸癌疫苗提供流行病學資料和理論依據(jù)。

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