王云云 楊小迪,2 楊雅平 黃京京 諸欣平**

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，北京 100069；2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，安徽蚌埠 233000)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一組易反復(fù)發(fā)作的免疫失調(diào)性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。其發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，環(huán)境、遺傳和免疫等多種因素導(dǎo)致了IBD的發(fā)生，其中免疫反應(yīng)異常是較為重要的因素(Scaldaferrietal.，2007；Qinetal.，2012)。近年來(lái)，一些研究證實(shí)，不同種類的蠕蟲(chóng)感染或蠕蟲(chóng)相關(guān)蛋白均可在一定程度上緩解腸道炎癥(Wangetal.，2008；Elliottetal.，2009；Johnstonetal.，2010)。Motomura等(2009)報(bào)道，旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體蛋白可在無(wú)活蟲(chóng)感染的情況下調(diào)控宿主腸道免疫。而旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)寄生于宿主腸道，直接與宿主相互作用，但旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體蛋白(Soluble adult proteins，SAP)是否能替代活蟲(chóng)感染對(duì)宿主腸道免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)，目前尚無(wú)報(bào)道，因此，本研究選用旋毛蟲(chóng)SAP，探討其對(duì)葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulphate sodium, DSS)誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠結(jié)腸炎的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑來(lái)源

雌性C57BL/6小鼠(體重18～22 g)、雌性ICR小鼠(體重22～25 g)、雌性Wistar大鼠(體重250～300 g)，均為清潔級(jí)動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。DSS(分子量40 000)購(gòu)自德國(guó)Applichem公司，細(xì)胞因子ELISPOT檢測(cè)試劑盒及鼠抗CD3、CD28單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)BD Phamingen公司。

1.2 蟲(chóng)株

實(shí)驗(yàn)所用旋毛蟲(chóng)種為本實(shí)驗(yàn)室ICR小鼠保種傳代的黑龍江豬源旋毛蟲(chóng)Trichinellaspiralis。

1.3 旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體勻漿蛋白制備

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法(涂濤等，2001)，收集旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)。通過(guò)研磨超聲和反復(fù)凍融使蟲(chóng)體徹底粉碎，13 000 g離心后取上清經(jīng)0.45 μm濾膜去除雜質(zhì)，即為SAP。用BCA(Bicinchoninic acid) 試劑盒測(cè)定蛋白含量，分裝，-80 ℃保存。

1.4 DSS小鼠結(jié)腸炎模型的建立及動(dòng)物分組

36只小鼠隨機(jī)均分為3組：對(duì)照組(PBS組)、腸炎組(PBS+DSS組)、蟲(chóng)體蛋白治療組(SAP+DSS組)，每組12只。腸炎組小鼠給予3% DSS溶液，連續(xù)飲用7 d，第5 d起小鼠逐漸出現(xiàn)血便、稀便，證明急性結(jié)腸炎誘發(fā)成功(Wirtzetal.，2007)。PBS組給予雙蒸水。治療組，在誘發(fā)腸炎的同時(shí)，每天經(jīng)腹腔注射25 μg SAP，PBS組和腸炎組注射PBS。實(shí)驗(yàn)期間，根據(jù)每天小鼠體重下降、糞便性狀及血便有無(wú)情況進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分(Disease activity index，DAI)(Muranoetal.，2000)，見(jiàn)表1。第7 d將小鼠處死取材檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Disease activity index (DAI) standard

正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛門的糊狀、半成形大便；稀便：可黏附于肛門的稀水樣狀。

Normal stools: well formed pellets; Loose: pasty stools which do not stick to the anus; diarrhea: Liquid stools that stick to the anus.

表2 結(jié)腸大體檢查評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Macroscopic inflammation score

表3 組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.3 Microscopic inflammation score

1.5 小鼠結(jié)腸大體與組織病理觀察

實(shí)驗(yàn)第7 d，取出小鼠結(jié)腸，用PBS溶液沖洗腸腔，取近直腸的部分結(jié)腸在甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋、切片(5 μm)，進(jìn)行HE染色。同時(shí)將結(jié)腸縱向剖開(kāi)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法，結(jié)合腸道粘連、結(jié)腸潰瘍、腸壁厚度及粘膜水腫情況等指標(biāo)進(jìn)行宏觀檢查評(píng)分(Bobin-Dubigeonetal.，2001), 見(jiàn)表2。顯微鏡下觀察組織切片，并根據(jù)粘膜是否完整、腺體隱窩消失程度、是否有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等指標(biāo)進(jìn)行組織損傷微觀評(píng)分(Dielemanetal.，1998)，見(jiàn)表3。

1.6 分離培養(yǎng)脾和腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細(xì)胞及ELISPOT方法檢測(cè)細(xì)胞因子

誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎后第7 d，處死小鼠，無(wú)菌取脾和MLN，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法(姚君等，2010)，提取淋巴細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼蘭染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)并調(diào)整到適宜的細(xì)胞濃度。將細(xì)胞加至ELISPOT 96孔板中，以anti-CD3和anti-CD28蛋白(終濃度為1 μg/mL)作為共刺激蛋白，在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組資料用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用方差分析q檢驗(yàn)比較各組資料間的差異，將P<0.05做為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分

建立腸炎模型的7 d中，正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常，未見(jiàn)稀便或血便，DAI評(píng)分無(wú)明顯變化；腸炎組小鼠在飲用3%DSS溶液第5 d起糞便中逐漸出現(xiàn)血便和稀便，伴有小鼠活動(dòng)減少、倦怠，體重下降明顯，隨時(shí)間延長(zhǎng)DAI評(píng)分逐漸增高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致(Muranoetal.，2000)；而SAP治療組小鼠活動(dòng)良好，少見(jiàn)稀便和血便，DAI評(píng)分低于腸炎組，兩組從第5 d起出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01，n=12)。見(jiàn)圖1。

2.2 小鼠結(jié)腸大體與宏觀、微觀評(píng)分及組織病理學(xué)變化

取小鼠結(jié)腸縱向剖開(kāi)進(jìn)行宏觀和微觀觀察及評(píng)分(圖2)。與正常組相比，腸炎組結(jié)腸可見(jiàn)明顯充血，腸壁增厚，鏡下可見(jiàn)若干粘膜缺損區(qū)。而SAP治療組的小鼠結(jié)腸炎癥較輕，粘膜結(jié)構(gòu)完整，腸壁增厚不明顯。治療組較腸炎組宏觀及微觀評(píng)分明顯降低，兩組相比有顯著性差異(P<0.01，n=12)。

圖1 DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎各組DAI評(píng)分的變化Fig.1 Changes of DAI from DSS-induced colitis of each groupDAI:疾病活動(dòng)指數(shù)Disease activity index；DSS:葡聚糖硫酸鈉 Dextran sulphate sodium；SAP:成蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)體蛋白 Soluble adult protein.(下同The same below.)**表示治療組與腸炎組相比有顯著性差異(P<0.01，n=12)，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(下同)**Indicates the significant differences between the therapy and colitis group (P<0.01，n=12).The values are presented as the mean ±SD(the same below).

圖2 DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎各組結(jié)腸大體與組織病理評(píng)分Fig.2 The macroscopic and microscopic score of colons from each groupA:小鼠結(jié)腸大體評(píng)分; B:小鼠組織病理學(xué)評(píng)分。A: the macroscopic score; B: microscopic score.

HE染色的結(jié)果顯示，正常對(duì)照組結(jié)腸粘膜層僅見(jiàn)一些散在分布的淋巴細(xì)胞，腺體隱窩排列整齊(圖3-A)。腸炎組結(jié)腸上皮粘膜損傷明顯，腺體隱窩結(jié)構(gòu)基本破壞，杯狀細(xì)胞丟失，粘膜及粘膜下層見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3-B)。SAP治療組小鼠結(jié)腸粘膜損傷明顯減輕，上皮結(jié)構(gòu)較完整，腺體隱窩排列較整齊，只有較少的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3-C)。

圖3 DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎組織病理學(xué)變化(HE染色，50×)Fig.3 Photomicrographs of histologically changes in colons(H&E staining，50×)A：PBS組；B：PBS+DSS組；C：SAP+DSS組.A: PBS group；B: PBS+DSS group；C: SAP+DSS group.

2.3 小鼠脾和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞細(xì)胞因子水平的測(cè)定

利用ELISPOT方法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌情況顯示，與對(duì)照組相比，腸炎組脾和MLN細(xì)胞中IFN-γ的分泌均顯著增加，而治療后，脾和MLN淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ均明顯下降；而IL-4(P<0.05，n=12)、IL-10(P<0.01，n=12)的分泌都顯著升高(圖4～5)。

圖4 DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎各組脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10分泌水平Fig.4 The level of cytokine IFN-γ、IL-4、IL-10 induced by anti-CD3and anti-CD28 from spleen lymphocyte*,**表示治療組與腸炎組相比有顯著性差異(* P<0.05，**P<0.01，n=12)，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(下同).*,**The significant differences between the therapy and colitis group (* P<0.05，**P<0.01，n=12.The values are presented as the mean ±SD (the same below).

圖5 DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎各組腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10分泌水平Fig.5 The level of cytokine IFN-γ、IL-4、IL-10 induced by anti-CD3and anti-CD28 from MLN lymphocyte

3 討論

近年來(lái)，大量的流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室及臨床試驗(yàn)表明：蠕蟲(chóng)感染可以抑制包括IBD在內(nèi)的多種免疫失調(diào)性疾病(Wangetal.，2008)。大多數(shù)IBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停憩F(xiàn)為Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(Qinetal.，2012)。蠕蟲(chóng)感染后，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Th2型為主的免疫反應(yīng)，通過(guò)抑制Th1型免疫反應(yīng)，有效緩解腸道炎癥(Elliottetal.，2009； Johnstonetal.，2010)。蠕蟲(chóng)的這種特性與伴隨宿主共同進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)分子有關(guān)(Hewitsonetal.，2009)。寄生蠕蟲(chóng)產(chǎn)生的異體蛋白、脂質(zhì)和排泄分泌物質(zhì)，一方面可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IL-4、IL-9、IL-13等 Th2型細(xì)胞因子，從而有效抑制IFN-γ、IL-12、IL-2、IL-1β等Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，緩解腸道炎癥；亦可通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等使紊亂的免疫反應(yīng)重新達(dá)到平衡(Ruyssersetal.，2009)。

研究證實(shí)，旋毛形線蟲(chóng)經(jīng)口感染可以減輕結(jié)腸炎癥，血清中IL-12及結(jié)腸組織中IFN-γ mRNA表達(dá)水平減低，而刺激脾分泌的IL-4、IL-13水平上調(diào)(Khanetal.，2002)。Motomura等(2009)報(bào)道，旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體抗原可替代活蟲(chóng)感染，通過(guò)上調(diào)結(jié)腸組織中 IL-13及TGF-β的水平，下調(diào)IL-1β的水平，從而改善腸道炎癥。而旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)寄生于宿主腸道，通過(guò)多種抗原物質(zhì)影響宿主的腸道免疫應(yīng)答，但此時(shí)期的蟲(chóng)體抗原是否亦可替代活蟲(chóng)感染調(diào)節(jié)宿主免疫，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選擇用旋毛蟲(chóng)SAP治療小鼠急性結(jié)腸炎，結(jié)果顯示，SAP治療后，小鼠腸炎癥狀得到緩解。同時(shí)檢測(cè)到，脾淋巴細(xì)胞和MLN細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)水平下降，Th2型細(xì)胞因子IL-4和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10表達(dá)量均上調(diào)。表明旋毛蟲(chóng)SAP對(duì)腸炎的抑制作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠外周和腸道局部免疫炎癥因子的分泌失衡來(lái)實(shí)現(xiàn)的，與文獻(xiàn)報(bào)道蠕蟲(chóng)相關(guān)蛋白緩解腸炎涉及的細(xì)胞免疫機(jī)制基本一致(Hewitsonetal.，2009)。但是蠕蟲(chóng)對(duì)免疫失調(diào)疾病的作用機(jī)制是復(fù)雜多樣的，因此，仍需對(duì)旋毛蟲(chóng)SAP緩解腸炎的免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。