黃詩(shī)瑩 邱潔蕾 譚栩穎 楊燦洪 郭 斌陳 濱 吳 焜 陳曉光

(南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，廣州 510515)

剛地弓形蟲Toxoplasmagondii是一種嚴(yán)重危害人、畜健康的機(jī)會(huì)性致病原蟲，呈世界性分布。該病的人群感染率極為普遍，全世界約有三分之一的人感染弓形蟲。弓形蟲能在孕期感染經(jīng)胎盤引起胎兒先天性弓形蟲病，導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)、畸胎等危害；獲得性弓形蟲病以多種組織器官損害為特點(diǎn)，尤其腦部和眼部為甚。對(duì)于免疫缺陷或免疫抑制者(如艾滋病或器官移植患者)，弓形蟲感染更是一個(gè)重要致死因素(陳曉光和鄭學(xué)禮, 2008；趙煥閣等, 2011)。致密顆粒蛋白(Dense granules antigen, GRA)是弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后釋放入納蟲泡(Parasitophorous vacuble, PV)的一類分泌代謝抗原(Tilleyetal., 1997)，其在人體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性和免疫原性(Caffaroetal., 2011)，現(xiàn)已報(bào)道有9種致密顆粒蛋白(Koetheetal., 2011)。本研究構(gòu)建弓形蟲RH株GRA7基因的重組質(zhì)粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7，在大腸埃希菌中分別以融合和非融合蛋白方式進(jìn)行表達(dá)，探討GRA7重組抗原的免疫反應(yīng)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蟲株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：弓形蟲RH株為本實(shí)驗(yàn)室液氮保種，SPF級(jí)雌性昆明小鼠(體重18～22 g)購(gòu)自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2菌株與質(zhì)粒：質(zhì)粒pET-28a(+)、pET-32a(+)和E.coli菌株BL21(DE3)、DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3主要試劑：基因組DNA提取試劑盒為QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit；質(zhì)粒提取試劑盒為OMEGA E.Z.N.A.? Plasmid Mini Kit I；限制性內(nèi)切酶為BioLabs公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶，高保真Taq DNA聚合酶、dNTPs為TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖、胰蛋白胨和酵母提取物為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；PVDF膜為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為OMEGA E.Z.N.A.Gel Extraction Kit;ECL試劑為Millipore Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate;二抗為武漢博士德生物工程有限公司HRP-羊抗小鼠IgG；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1弓形蟲RH株基因組DNA的提?。豪ッ餍∈蠼?jīng)腹腔接種弓形蟲RH株感染3天后，收集腹水純化弓形蟲速殖子，提取弓形蟲基因組DNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增GRA7基因：參考GenBank中弓形蟲RH株GRA7基因序列(DQ459443.2)，用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)所需的引物。P1序列為5′-ACATGGATCCATGGCCCGACGCAATT-3′，P2序列為5′-ACGAGAATTCCTACTGGCGGGCATCC-T-3′。在上下游引物中分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線處)，用高保真Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)如下：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 60 s, 共30個(gè)循環(huán)；最后再延伸72℃ 7 min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.3目的基因GRA7的回收和測(cè)序：PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化后進(jìn)行雙酶切，然后分別與pET28a(+)和pET32a(+)載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α,分別鋪板于LB/Kan和LB/Amp固體培養(yǎng)基表面，37℃過夜培養(yǎng)。挑數(shù)個(gè)單菌落分別接種于LB/Kan和LB/Amp培養(yǎng)液中，37℃以250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒提取試劑提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定及EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司測(cè)序。序列分析鑒定無誤后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)中。

1.2.4重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)：分別將兩種轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落接種于含抗生素的LB培養(yǎng)液中，37℃ 過夜培養(yǎng)，次日以1∶100接種于20 mL 含抗生素的培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，于37℃ 250 r/min培養(yǎng)至吸光度(A600nm)達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1 mmol/L。 pET28a-GRA7/BL21于25℃ 110 r/min繼續(xù)培養(yǎng)4 h，pET32a-GRA7/BL21于37℃ 250 r/min繼續(xù)培養(yǎng)4 h離心，分別收集菌體，加入蛋白上樣緩沖液重懸菌體煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.5Western blotting分析：將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后通過半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，進(jìn)行Western blotting分析，一抗為本室制備的弓形蟲PRU株慢性感染小鼠血清，以1∶100稀釋；二抗為HRP-羊抗小鼠IgG，以1∶5 000稀釋；用化學(xué)發(fā)光法ECL顯跡。

2 結(jié)果

2.1 GRA7基因獲取

提取弓形蟲基因組DNA，經(jīng)高保真PCR擴(kuò)增GRA7基因，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見單一條帶，其大小約710 bp，與理論值相符。測(cè)序結(jié)果與已發(fā)布的弓形蟲RH株GRA7基因cDNA序列同源性為100%。

2.2 GRA7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

兩種重組質(zhì)粒分別經(jīng)PCR鑒定，陽性重組克隆能擴(kuò)增出710 bp左右的目的片段；用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后可見大小為710 bp目的片段以及載體條帶(pET28a(+)為5 300 bp左右、pET32a(+)為5 900 bp左右)(圖1-A,B)，證明GRA7基因已成功克隆入pET28a(+)與pET32a(+)載體，且測(cè)序結(jié)果顯示插入序列無誤。

2.3 重組GRA7蛋白的表達(dá)

重組質(zhì)粒pET32a-GRA7轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組GRA7蛋白以融合蛋白的形式在大腸桿菌BL21胞內(nèi)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，融合蛋白相對(duì)分子量約為45 kDa，與理論值相符。空載體pET32a(+)與重組質(zhì)粒pET32a-GRA7在誘導(dǎo)前均未出現(xiàn)明顯特異的表達(dá)蛋白條帶(圖2)。

重組質(zhì)粒pET28a-GRA7轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，GRA7以非融合蛋白的形式在大腸桿菌BL21胞內(nèi)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，未在預(yù)期29 kDa處發(fā)現(xiàn)特異蛋白條帶，不排除是因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)量少，肉眼不可見，進(jìn)一步Western blotting分析。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定Fig.1 Restriction and PCR analysis of the recombinant plasmidA. pET28a-GRA7鑒定. M1：100 bp DNA ladder；1：pET28a-GRA7 PCR結(jié)果；2：pET28a-GRA7 BamHⅠ 和 EcoRⅠ雙酶切； 3：pET28a-GRA7 BamHⅠ單酶切；4：pET28a(+)BamHⅠ單酶切；M2：1 kbp DNA ladder. B. pET32a-GRA7鑒定. M1. 100 bp DNA ladder；1. pET32a-GRA7 PCR結(jié)果；2. pET32a-GRA7 BamHⅠ 和EcoRⅠ雙酶切；3. pET32a-GRA7 BamHⅠ單酶切；4. pET32a(+)BamHⅠ單酶切；M2. 1 kbp DNA ladder.A.Analysis of pET28a-GRA7.M1:100 bp DNA ladder; 1: PCR product of plasmid pET28a-GRA7; 2: pET28a-GRA7 digested by BamHⅠ and EcoRⅠ; 3: Plasmid pET28a-GRA7 digested by BamHⅠ; 4: Plasmid pET28a(+)digested by BamHⅠ; M2: 1 kbp DNA ladder.B.Analysis of pET32a-GRA7.M1: 100 bp DNA ladder; 1: PCR product of plasmid pET32a-GRA7; 2: pET32a-GRA7 digested by BamHⅠ and EcoRⅠ; 3: Plasmid pET32a-GRA7 digested by BamHⅠ; 4: Plasmid pET32a(+) digested by BamHⅠ; M2: 1 kbp DNA ladder.

圖2 重組GRA7蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteinM：蛋白標(biāo)志物；1：誘導(dǎo)前pET32a(+)/BL21；2：誘導(dǎo)后pET32a(+)/BL21；3：誘導(dǎo)前pET32a-GRA7/BL21；4：誘導(dǎo)后pET32a-GRA7/BL21；5：誘導(dǎo)前pET28a(+)/BL21；6：誘導(dǎo)后pET28a(+)/BL21；7：誘導(dǎo)前pET28a-GRA7/BL21；8：誘導(dǎo)后pET28a-GRA7/BL21.M：Prestained Protein Ladder;1: Total cell lysate of pET32a(+)/BL21 uninduced; 2: Total cell lysate of pET32a(+)/BL21 induced; 3:Total cell lysate of pET32a-GRA7/BL21 uninduced; 4: Total cell lysate of pET32a-GRA7/BL21 induced; 5: Total cell lysate of pET28a(+)/BL21 uninduced;6: Total cell lysate of pET28a(+)/BL21 induced; 7: Total cell lysate of pET28a-GRA7/BL21 uninduced; 8: Total cell lysate of pET28a-GRA7/BL21 induced.

2.4 重組蛋白的免疫反應(yīng)性分析

以弓形蟲PRU株慢性感染小鼠血清與重組GRA7蛋白進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示pET32a-GRA7誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白能被弓形蟲慢性感染小鼠血清特異性識(shí)別(圖3)。pET28a-GRA7誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白與弓形蟲慢性感染小鼠血清在預(yù)期位置未見明顯特異條帶。

圖3 pET32a-GRA7重組蛋白的Western blotting分析Fig.3 Wesrern blotting analysis of recombinant protein pET32a-GRA71：pET32a-GRA7/BL21誘導(dǎo)前；2：pET32a-GRA7/BL21誘導(dǎo)后.1：pET32a-GRA7 uninduced; 2：pET32a-GRA7 induced.

3 討論

快速準(zhǔn)確地診斷弓形蟲感染是弓形蟲病研究的重要內(nèi)容。利用基因工程技術(shù)方法獲取高純度的特異蛋白作為診斷抗原，有助于提高弓形蟲病診斷的敏感性和特異性。弓形蟲GRA7蛋白在宿主與弓形蟲的相互作用中起重要作用(Cesbron-Delauw,1994)，其在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性和免疫原性。鄭斌等(2005)的研究表明，GRA7在不同株的弓形蟲間具有基因的高度保守性，故GRA7可作為理想的診斷抗原。機(jī)體抗弓形蟲保護(hù)性免疫主要為γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)等細(xì)胞因子介導(dǎo)的Th1型細(xì)胞免疫。Vercammen等(2000)和Cong等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，GRA7蛋白能免疫誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，為GRA7蛋白成為疫苗候選分子提供了有力依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)克隆得到的弓形蟲RH株GRA7基因序列與GenBank登錄的弓形蟲RH株GRA7基因序列(登錄號(hào)DQ459443.2)一致。本研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a-GRA7能在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)GRA7融合蛋白， Western blotting分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能被弓形蟲慢性感染血清特異識(shí)別，為弓形蟲GRA7蛋白的診斷和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-GRA7，但經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在理論值29 kD附近未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的特異性表達(dá)條帶。Western blotting分析結(jié)果顯示未見特異條帶。據(jù)報(bào)道，Sadeghiani等(2009)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28b-GRA7并高效表達(dá)蛋白，且該蛋白對(duì)弓形蟲急性感染的血清有強(qiáng)烈的反應(yīng)。pET28b(+)與pET28a(+)基因序列基本相同，只存在一個(gè)核苷酸的差異，前者在BamHⅠ酶切位點(diǎn)前增加一個(gè)胞嘧啶。該文獻(xiàn)的重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)方法可為我們進(jìn)一步探索pET28a-GRA7的表達(dá)提供借鑒。