付鳳洋 陳 斌** 鐘代斌 孟鳳霞 閆振天 何正波 閆桂云

(1. 重慶師范大學(xué)昆蟲與分子生物學(xué)研究所，重慶 401331；2. College of Health Sciences, University of California at Irvine, CA 92697, USA; 3.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206)

中華按蚊Anophelessinensis是我國的主要傳瘧媒介之一(Chow, 1991; Liuetal., 2011)，媒介蚊蟲的控制是預(yù)防瘧疾傳播的重要措施。目前，媒介蚊蟲的控制主要通過使用殺蟲劑浸泡蚊帳和室內(nèi)滯留噴灑(WHO, 2009)。擬除蟲菊酯因其對人低毒、滅蟲效率高以及2～6個月的殘效期在媒介蚊蟲和農(nóng)業(yè)害蟲控制方面被廣泛選擇使用(WHO, 2005)。廣泛大量地使用擬除蟲菊酯增強(qiáng)了蚊蟲抗藥性的選擇壓力(Overgaardetal., 2005)。我國不同地區(qū)的蚊蟲抗性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，多種媒介蚊蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性(劉維德, 1990; 劉斯璐等, 2011)。了解蚊蟲的殺蟲劑抗性水平，研究其抗性機(jī)理對建立起可靠的抗性檢測方法和有效的蚊蟲監(jiān)控十分必要。非洲傳瘧媒介岡比亞按蚊An.gambiae對擬除蟲菊酯抗性已有了深入研究(Ransonetal., 2009；Kawadaetal., 2011)。研究表明，岡比亞按蚊para型鈉離子通道基因的突變改變了神經(jīng)系統(tǒng)對殺蟲劑的敏感性從而產(chǎn)生對擬除蟲菊酯的擊倒抗性(Knockdown resistance,kdr) (Chenetal., 2008)。para型鈉離子通道基因中多個位點(diǎn)的突變在多種按蚊中與擬除蟲菊酯抗性有關(guān)，其中最常見的突變位于para型鈉離子通道SII6片段的1014點(diǎn)位，被稱為kdr基因(Kimetal., 2007; Singhetal., 2011)。

重慶地區(qū)20世紀(jì)80年代開始采用擬除蟲菊酯類殺蟲劑控制媒介蚊蟲，對蚊媒傳播疾病的控制發(fā)揮了巨大的作用。1992和2001年重慶市疾控中心對該地區(qū)瘧疾傳播媒介中華按蚊進(jìn)行了抗性監(jiān)測，監(jiān)測結(jié)果顯示該地區(qū)的中華按蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性(蔣詩國等, 1993; 蔣詩國等, 2002)。進(jìn)一步開展重慶地區(qū)中華按蚊對擬除蟲菊酯抗性水平檢測，除蟲菊酯類殺蟲劑抗性與kdr基因突變關(guān)系的研究對弄清其抗性機(jī)理具有重要意義。我們在重慶市璧山和秀山縣廣泛采集了中華按蚊，結(jié)合實驗室飼養(yǎng)品系，采用WHO標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分劑量法檢測了這兩個縣中華按蚊對溴氰菊酯的抗性水平；用PCR方法擴(kuò)增和測序檢測了kdr基因的突變，以了解目前重慶市中華按蚊對溴氰菊酯的抗性水平，及其抗藥性與kdr基因突變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 蟲源

2011年7～9月在重慶市壁山縣、秀山縣各50個按蚊幼蟲生長環(huán)境，分別采集按蚊幼蟲1 000余頭(圖1)，用酵母與魚食1∶1混合飼料將幼蟲飼養(yǎng)至成蟲。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定選取中華按蚊(陸寶麟等, 1997)，挑選雌性中華按蚊用10%葡萄糖水飼養(yǎng)3日后用于抗藥性生物測定。中華按蚊敏感品系來源于江蘇省，在重慶師范大學(xué)昆蟲與分子生物學(xué)研究所建立實驗室種群。

圖1 重慶市采樣地圖Fig.1 Map of sampling sites in Chongqing, China1：璧山縣；2：秀山縣.1.Bishan County; 2. Xiushan County.

1.2 抗藥性生物測定

使用WHO標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分劑量法(WHO, 1998)，0.05%溴氰菊酯藥膜由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所按照WHO推薦的方法制備(劉維德, 1979)。每個檢測點(diǎn)測試100～110只蚊蟲，同時設(shè)空白對照。室溫25～27℃、相對濕度80%，藥膜接觸1 h分別記錄接觸10、15、20、30、40、50、60 min蚊蟲擊倒數(shù)，計算擊倒率。以10%葡萄糖水恢復(fù)飼養(yǎng)24 h后檢查死亡蚊數(shù)和存活蚊數(shù)，計算死亡率。并將生物測定后蚊蟲記錄存活狀態(tài)單只無水乙醇保存。抗性判定標(biāo)準(zhǔn)：死亡率98%以上為敏感型(S)；死亡率80%～98%之間為初步抗性(M)；死亡率80%以下為抗性(R)。

1.3 DNA提取

生物測定后單只無水乙醇保存樣本用Fast Tissue-to-PCR Kit (Fermentas) 分別提取基因組DNA。拔取蚊腿放入1.5 mL離心管中，加入50 μL組織裂解液和5 μL蛋白酶K，55℃ 孵育20 min，95℃ 孵育3 min，加入50 μL中和液漩渦振蕩混勻。提取液14 000 r/min 離心5 min，將提取液保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分子鑒定和kdr突變檢測

野外形態(tài)鑒定為中華按蚊并作了生測的個體，在測序檢測kdr突變前需作分子鑒定以確信是中華按蚊。只有被分子鑒定為中華按蚊的個體才用于結(jié)果分析。中華按蚊分子鑒定使用特異性引物擴(kuò)增ITS2和28S rDNA區(qū)域(D1和D2) (Joshietal., 2010)。檢測中華按蚊kdr突變，從NCBI下載中華按蚊para型Na+通道SII5-SII6片段的序列(DQ334052.1)，設(shè)計引物(Kdr-F: TGCCACTCCGTGTGTTTAGA和Kdr-R: GAGCGA TGATGATCCGAAAT)，PCR擴(kuò)增kdr基因。PCR反應(yīng)體系(總體積25 μL)為：模板(DNA提取液)8 μL，ddH2O 8.75 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 2 μL，MgCl21.5 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL，10 μmol/L引物(Kdr-F和Kdr-R)各1 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min預(yù)變性；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，送華大基因科技有限公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果使用EMBL-EBL在線工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_sixpack/)翻譯其所編碼的氨基酸序列，并利用BioEdit序列分析軟件比對分析突變。使用JMP9.0 軟件統(tǒng)計分析抗藥性生物測試數(shù)據(jù)(溴氰菊酯60 min擊倒率和致死率)以及kdr等位基因頻率。使用VassarStats在線統(tǒng)計工具(http://vassarstats.net/index.html)采用卡方(χ2)檢驗中華按蚊的溴氰菊酯抗性和kdr突變的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1 抗性水平

生物測定結(jié)果顯示，璧山縣中華按蚊首只擊倒時間為31 min，在60 min內(nèi)的擊倒率為16.36%，恢復(fù)24 h后的校正死亡率為32.72%，為抗性種群；秀山縣中華按蚊首只擊倒時間為第37 min，擊倒率為6.80%，校正死亡率為12.62%為抗性種群；實驗室飼養(yǎng)品系首只擊倒時間為8 min，擊倒率為100%，校正死亡率為100%，為敏感種群(表1)。

表1 中華按蚊對溴氰菊酯的抗藥性Tab.1 The bioassay of deltamethrin resistance in Anopheles sinensis

2.2 突變檢測結(jié)果及其分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳顯示在DNA Marker的250和500 bp之間有1條帶(圖2)。璧山縣樣品檢測76只，其中生物檢測24 h恢復(fù)存活蚊40只，死亡蚊36只；秀山縣樣品檢測43只，其中生物檢測24 h恢復(fù)存活蚊30只，死亡蚊13只；實驗室飼養(yǎng)品系樣品檢測15只，其中生物檢測24 h恢復(fù)存活蚊0只，死亡蚊15只。

圖2 中華按蚊kdr基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of kdr in An. sinensisM:DL2000;1：璧山縣樣本；2：秀山縣樣本；3：實驗室種群樣本.M:DL2000;1：Sample from Bishan County; 2: Sample from Xiushan County; 3:Sample from laboratory population.

測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增所得片段大小為325 bp，將測序在NCBI上進(jìn)行Blast搜索，與其相似度最高的是中華按蚊kdr基因，相似度達(dá)99%，證實所得序列為中華按蚊kdr基因。擴(kuò)增序列推導(dǎo)出其蛋白質(zhì)氨基酸序列73個氨基酸殘基，與敏感性岡比亞按蚊、中華按蚊kdr基因氨基酸比對，在已報道的1014位點(diǎn)檢測到突變。璧山縣樣品中檢測到1種突變類型，由亮氨酸(L1014)改變?yōu)楸奖彼?L1014F)；秀山縣樣品中檢測到2種突變類型，由亮氨酸(L1014L)改變?yōu)楸奖彼?L1014F)、半胱氨酸(L1014C)；實驗室飼養(yǎng)品系樣品中未檢測到突變類型(圖3)。查看測序峰圖，璧山縣L1014位點(diǎn)密碼子存在野生型TTG純合樣本(TTG/TTG)、突變TTT純合樣本(TTT/TTT)以及雜合樣本(TTG/TTT)；秀山縣L1014位點(diǎn)密碼子存在野生型TTG純合樣本(TTG/TTG)、突變TTT純合樣本(TTT/TTT)、TGT純合樣本(TGT/TGT)以及雜合樣本(TTG/TTT)、(TTT/TGT)和(TTG/TGT)；實驗室飼養(yǎng)品系全為野生型TTG純合樣本(TTG/TTG)。

璧山縣群體基因突變頻率較低，為7.23%， 而秀山縣群體基因突變頻率較高，為68.60%。璧山縣群體存活蚊中野生型TTG等位基因頻率為91.25%，突變型TTT等位基因頻率為8.75%；死亡蚊中野生型TTG等位基因頻率為94.44%，突變型TTT等位基因頻率為5.56%。突變基因型TTT與抗藥性性狀間無關(guān)聯(lián)(χ2=0.2，P=0.6547)。秀山縣群體存活蚊野生型TTG等位基因頻率為35.00%，突變型TTT+TGT等位基因頻率為65.00%；死亡蚊中野生型TTG等位基因頻率為23.08%，突變型TTT+TGT等位基因頻率為76.92%。突變基因型TTT與TGT均與抗藥性性狀間無關(guān)聯(lián)(TTT：χ2=0.30，P=0.4166；TGT：χ2=0.30，P= 0.3833)(表2)。

圖3 kdr基因氨基酸序列對比Fig.3 The alignment of kdr amino acid sequences from different populations of An. sinensisAn. gambiae和An. sinensis的NCBI序列號分別為CAA73920.1和ABC60026.1。BS_1014L和BS_1014F：璧山縣樣品kdr基因氨基酸序列；XS_1014L、XS_1014F和XS_1014C：秀山縣kdr基因樣品氨基酸序列；LS_1014L：實驗室飼養(yǎng)kdr基因氨基酸序列；□：kdr基因氨基酸序列L1014位點(diǎn)(Leu→Phe/Cys).The GenBank accession numbers for An. gambiae and An. sinensis are respectively CAA73920.1 and ABC60026.1. BS_1014L and BS_1014F: sequences from Bishan; XS_1014L, XS_1014F and XS_1014C: sequences from Xiushan; LS_1014L: sequence from laboratory population; □: L1014 site of the kdr gene whose mutation results in amino acid change from Leu (wild) to Phe/Cys.

采集點(diǎn)Study site存活狀態(tài)Survival/Dead檢測數(shù)NumberL1014位點(diǎn)等位基因頻率(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)L1014 site allele frequency(%±SE)TTGTTTTGT突變型等位基因頻率 (%)Mutation site allele frequency (%)璧山縣S4091.25±3.198.75±3.1908.75±3.19Bishan CountyD3694.44±3.295.56±3.2905.56±3.29秀山縣S3035.00±4.8645.00±7.2720.00±5.6565.00±4.86Xiushan CountyD1323.08±9.7253.84±9.0023.08±9.7276.92±9.72

3 討論

重慶市位于中國內(nèi)陸西南部, 屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，境內(nèi)河流縱橫交錯，稻田星羅分布，氣候地理條件特別適合蚊蟲滋生繁殖。重慶市蚊蟲種類有10屬73種，能轉(zhuǎn)播疾病的種類如中華按蚊、雷氏按蚊An.lesteri、致倦庫蚊Culexpipiensquinquefasciatus、白紋伊蚊Aedesalbopictus等蚊蟲都有廣泛分布(季恒青等, 2009)。歷史上重慶市是我國瘧疾高發(fā)區(qū)，中華按蚊是主要的傳播媒介之一(吳成果等, 2011)。70年代末引進(jìn)的溴氰菊酯是目前殺蟲活性最高的殺蟲劑之一，具有高效、低毒、低殘留、在人體內(nèi)易生物降解等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于媒介蚊蟲的控制(Carfetal., 1990)。殺蟲劑的持續(xù)使用，蚊蟲不可避免的產(chǎn)生了抗性。蔣詩國等(1993)對重慶市的中華按蚊溴氰菊酯抗性水平首次進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該地區(qū)的中華按蚊已具有初級抗性(死亡率：80.72%)。2001年再次檢測該地區(qū)中華按蚊對溴氰菊酯的抗性水平，檢測結(jié)果為抗性(死亡率：76.92%)(蔣詩國等, 2002)。本次檢測結(jié)果：璧山縣種群死亡率為32.72%，秀山縣為12.62%。抗性水平進(jìn)一步增加，這可能與公共衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域大量持續(xù)使用溴氰菊酯有關(guān)。有關(guān)衛(wèi)生部門需注意采取有效措施，防止中華按蚊抗藥性的進(jìn)一步提高。

蚊蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性的機(jī)制研究主要集中于代謝抗性和靶標(biāo)位點(diǎn)抗性。擬除蟲菊酯類殺蟲劑主要靶標(biāo)位點(diǎn)為para型鈉離子通道，靶標(biāo)位點(diǎn)突變引起其對殺蟲劑產(chǎn)生抗擊到抗性。目前，在對擬除蟲菊酯已經(jīng)產(chǎn)生抗性的岡比亞按蚊、阿拉伯按蚊An.arabiensis、庫態(tài)按蚊An.culicifacies和斯氏按蚊An.stephensi檢測發(fā)現(xiàn)，para型鈉離子通道kdr基因第1014位密碼子發(fā)生了突變，突變類型包括L1014F、L1014S和L1014C(Kimetal., 2007; Chenetal., 2008; Singhetal., 2011)。在河南、安徽等地的中華按蚊種群中，鈉離子通道IIS6節(jié)段檢測到了L1014F、L1014C等兩種突變類型(武松等, 2010; 祁欣等, 2011; Tanetal., 2012b)，在我國廣西省和越南的湄公河地區(qū)檢測到L1014S突變類型(Tanetal., 2012a; Verhaeghenetal., 2010)。本研究對采自重慶的中華按蚊Na+通道IIS6節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)有L1014F、L1014C兩種突變類型，與安徽、河南等地中華按蚊的突變類型一致，未發(fā)現(xiàn)L1014S突變類型。河南、安徽等地的中華按蚊種群中沒有發(fā)現(xiàn)野生型TTG，而采自璧山縣的中華按蚊中野生型TTG純合子比例達(dá)到90.78%，與安徽(16.35%～23.76%)(武松等, 2011)、河南(2.73%～4.90%)(祁欣等, 2011)等地報道中華按蚊生物檢測擊倒率無明顯差異。

璧山縣種群和秀山縣種群基因突變與抗藥性的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果未達(dá)顯著水平。本次調(diào)查僅針對para型Na+通道IIS6節(jié)段的kdr基因，其他節(jié)段基因是否有突變以及對擊倒抗性是否有影響有待進(jìn)一步研究。